成人骨髓源内皮祖细胞的体外分离培养及鉴定_温昱

Abstract： Objective To investigate the feasibility of adult human bone marrow-derived endothelial progenitor cells （ EPCs） isolated and cultured in vitro． Methods Adult human bone marrow was extracted，then the whole marrow was cultured in vitro． After primary cells were passaged，CD1+33 cells were sorted by microbeads instrument and cultured with EGM-MV2． The cell growth curve was drawn after separation and passage to observe cell growth capacity． Flow cytometry was used to detect the purity of CD3+4 and CD1+33 cells． Cell specific molecule CD133 ，CD34 ，and VE-cadherin expression were detected by immunofluorescence． Transmission electron microscope was used to observe the ultrastructure of sorted cells． FITC labeled UEA-1 and Dil labeled ac-LDL were used to label cells and detect cell phagocytosis． Results The human bone marrow CD1+33 cells began to form cell clusters 3 days after cell sorting and cell morphology formed typical string-ofbeads-like 3 days after passage； cells went into platform phase on day 5-6 after passage． The rate of CD3+4 and CD1+33 cells were 24． 13% and 93． 29% respectively，the cells presented CD133 ，CD34 and VE-cadherin． The cells could phagocytose Dil-ac-LDL and combine with UEA-1． Conclusions EPCs isolated and cultured from human bone marrow showed many stable biological characteristics，such as modality，proliferation rate，cell growth capacity，expression of surface marker and function，and may be used as a kind of ideal cell for tissue engineering or stem cell therapy．
～ 90% 融合需 5 ～ 6 d。传代细胞形态为短梭形，生 长潜伏期不足 1 d，倍增时间约为 2 d； 第 6 ～ 7 d 达 60% 融合，细胞多数分散均匀生长，呈典型串珠样排 列； 经过 2 ～ 3 代后可获得（ 1 ～ 2） × 106 个细胞，基 本可达移植和细胞诱导分化要求的数量。 2． 2 细胞生长周期 EPCs 接种第 2 天细胞数量即 开始增加，对数生长期为 3 ～ 6 d，至第 7 天数量达 4． 43 × 105 / ml，之后进入平台期，见图 1。
关键词： 骨髓； 内皮祖细胞； 细胞培养； 细胞鉴定 中图分类号： R329． 2 文献标志码： A 文章编号： 1002-266X（ 2011） 43-0006-03
Isolation，culture and identification of adult human bone marrow-derived endothelial progenitor cells in vitro WEN Yu1 ，LI Bin，DANG Rui-shan，ZHANG Chuan-sen （ 1 Department of Histoembryology，China Medical University，Shenyang 110001，P． R． China）
EPCs 为内皮细胞的前体细胞，属多能干细胞， 存在 于 骨 髓、脐 血 和 外 周 血 中，可 分 化 为 内 皮 细 胞［6］； 文 献 报 道 EPCs 有 吞 噬 低 密 度 脂 蛋 白 的 功 能［7］。相对于外周血和脐血来说，骨髓中 EPCs 的 含量更为丰富，且易于获取和体外分离培养，增殖能 力强，属自体来源，无免疫排斥反应。因此，本实验 选择骨髓来源 EPCs 作为研究对象。目前对 EPCs 的常用分离方法包括单个核细胞贴壁分离法、密度 梯度离心分离法和根据细胞表面标志通过流式细胞 仪或免疫磁珠分离出阳性细胞群，然后采用条件培 养基Hale Waihona Puke Baidu壁培养［8 ～ 10］。单个核细胞贴壁分离法易于 操作、费用低、仪器要求不高，但得到的 EPCs 纯度 较低； 而根据细胞表面标志获得的细胞纯度较高，利 用 CD133 作为 EPCs 的表面标记进行分离可除去内皮 细胞干扰，从而使分离细胞更为纯化。
山东医药 2011 年第 51 卷第 43 期
成人骨髓源内皮祖细胞的体外分离 培养及鉴定
温 昱1* ，李 彬2 ，党瑞山3 ，张传森3 （ 1 中国医科大学组织胚胎学教研室，沈阳 110001； 2 中国医科大学附属盛京医院； 3 中国人民解放军第二军医大学解剖学教研室）
摘要： 目的 探讨成人骨髓源内皮祖细胞（ EPCs） 体外分离培养的可行性。方法 抽取成年男性骨髓，体外全 骨髓培养，传代后采用免疫微珠分选方法收集 CD1+33 细胞，EGM-MV2 条件培养基诱导培养 EPCs，观察细胞形态、生 长情况； 采用流式细胞技术检测分选细胞纯度，免疫荧光法检测 EPCs 特殊分子标志物 CD34 、CD133 和 VE-cadherin 表 达，透射电子显微镜观察分选细胞超微结构，UEA-1 和 Dil-ac-LDL 双染色法检测分选细胞的吞噬功能。结果 分 选后细胞培养第 3 天出现集落样生长，集落边缘细胞形态伸展呈梭形或多边形，传代后呈现串珠样排列； 培养至 5 ～ 6 d，细胞连接成大片条索状结构； CD3+4 、CD1+33 细胞百分率分别为 24． 13% 、93． 29% ，其表面特异性表达 CD133 、 CD34 、VE-cadherin，具有 EPCs 形态特征，能吞噬 Dil-ac-LDL 并结合 UEA-1。结论 成人骨髓来源的 EPCs 经体外培 养后形态、增殖率、生存能力、表面标志表达、功能等均较为稳定，可作为心血管组织工程种子细胞或用于干细胞治 疗。
图 1 EPCs 生长曲线
2． 3 细胞纯度 经 CD133 免疫磁珠分选后，CD3+4 、 CD1+33 细胞百分率分别为 24． 13% 、93． 29% 。 2． 4 细胞鉴定情况 ①表面特异标志： EPCs 表达 CD133 、CD34 和 VE-cadherin，不表达 CD45 和 CD31 。② 超微结构： 细胞核不规则、核质比大，胞质内见致密 内皮颗粒。③ 吞噬功能： 激光共聚焦显微镜显示 Dil-ac-LDL 和 FITC-UEA-1 双染色均为阳性。 3 讨论
Key words： bone marrow； endothelial progenitor cells； cell culture； cell identification
自 Asahara 等发现并分离培养外周血中内皮祖 细胞（ EPCs） 后［1］，许多研究陆续证实 EPCs 对创伤 愈合、肢体缺血、心肌梗死、血管移植物再血管化、随 意皮瓣存活、移植皮肤血管新生等过程中的血管再
基金项目： 国家自然科学基金资助项目（ 30672045） 。 * 通讯作者
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生起重要作用［2］。目前关于大鼠、兔和犬骨髓来源 EPCs 的体外分离、培养及鉴定方法已有报道［3 ～ 5］， 但关于成人骨髓 EPCs 体外纯化、培养及鉴定的报 道较少。2010 年 5 月，我们对成人骨髓源 EPCs 进 行了体外分离培养及鉴定，旨在为其临床研究和应 用奠定基础。 1 材料与方法
山东医药 2011 年第 51 卷第 43 期
1． 1 材 料 CD133 一 抗 及 微 珠，CD133 -FITC，CD34 PE，FITC-二抗，Cy3-二抗，CD34 ，CD31 ，CD133 ，内皮细 胞生 长 培 养 基 （ EGM ） -MV2，DMEM-低 糖 培 养 基 （ LG） 血 管 内 皮 细 胞 钙 依 赖 性 黏 附 素 （ VE-cadherin） ； 成年男性纯化骨髓 CD1+33 细胞。 1． 2 细 胞 扩 增、纯 化 将 成 年 男 性 骨 髓 采 用 含 20% FBS 的 DMEM-LG 于体外进行全骨髓培养，传 代后采用 CD133 免疫磁珠分选 CD1+33 细胞，将得到的 纯化骨髓 CD1+33 细胞加入含 EGM-MV2 的培养瓶中 培养，细 胞 生 长 至 80% ～ 90% 融 合 时 PBS 洗 涤 2 次，0． 25% 胰酶 37 ℃ 消化 1 min，吸管吹打至细胞完 全脱壁为单细胞悬液，1 000 r / min 离心 5 min，弃上 清； EGM-MV2 重悬细胞，以（ 1 ～ 2） × 105 / ml 重新接 种于 25 cm2 培养瓶中。 1． 3 细胞生长周期及纯度测定 ①生长周期： 取第 3 代 CD1+33 细胞以 1． 6 × 105 / ml 接种至 24 孔板（ 200 μl / 孔） ，共接种 21 孔，移入培养箱中。此后每天取 3 孔行锥虫蓝染色，计数活细胞数（ 取 3 孔平均值） ， 连续 7 d，绘制细胞生长 曲 线。② 纯 度： 取 第 5 代 CD1+33 细胞消化为单细胞悬液，PBS 漂洗，分别加入 CD34 -PE（ 1 ∶ 100 ） 和 CD133 -FITC （ 1 ∶ 100 ） ，避光静置 30 min 后 PBS 漂洗，2 000 r / min 离心 5 min，PBS 漂 洗，流式细胞仪（ 488 nm） 检测 CD3+4 、CD1+33 细胞百分 率。 1． 4 细胞鉴定 ①表面特异标志检测： 取第 5 代 CD1+33 细胞爬片，4% 多聚甲醛室温固定 10 min，10% 羊血清 37 ℃ 封闭 30 min，加一抗 4 ℃ 过夜。二抗分 别为 Cy3 标记的羊抗兔 IgG（ 1 ∶ 200） 、FITC 标记的 羊抗兔 IgG（ 1 ∶ 150） 、FITC 标记的兔抗鼠（ 1 ∶ 150） ， 室温 40 min，阴 性 对 照 用 抗 体 稀 释 液 代 替 一 抗。 DAKO 公司荧光封片剂封片，荧光显微镜下观察。 ②超微结构观察： 取第 4 代 CD1+33 细胞，胰酶消化后 加入 EGM-MV2，吹打至细胞脱壁，2 000 r / min 离心 5 min，取沉淀用 2． 5% 戊二醛固定，超薄切片，透射 电子显微镜观察拍照。③吞噬功能检测： 细胞传代 培养第 7 天，将贴壁细胞与 Dil-ac-LDL（ 10 mg / L） 于 37 ℃ 孵育 4 h，4 ℃ 冰丙酮固定 10 min，PBS 浸洗 2 次后加入 FITC-UEA-1（ 10 mg / L） ，37 ℃ 孵育 1 h，激 光共聚焦显微镜观察 Dil-ac-LDL 和 UEA-1 双染色 阳性细胞，即 EPCs 对 Dil-ac-LDL 的吞噬率。 2 结果 2． 1 细胞扩增及培养 分选后细胞大部分在 24 h 内贴壁，初时体积较小，呈类圆形或多角形； 第 3 天 贴壁细胞以生长良好的细胞为中心，呈集落样生长， 集落边缘细胞形态伸张为梭形或长多角形，达 80%