环介导等温扩增技术
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
环介导等温扩增技术
2015307360 吴祖雄
定义：针对靶基因的 6个区域设计4种特异引物，在链 置换 DNA 聚合酶 (Bst DNA polymerase) 的作用下， 60--65℃恒温扩增，15-60分钟左右即可实现 10^9～ 10^10倍的核酸扩增。
①扩增目的片段时依赖的是一种具有链置换特性的 Bst DNA聚合酶 ②需四条能够识别靶序列六个特异区域的引物 ③LAMP法并不需要对双链DNA进行预变性及进行温度 循环
LAMP可用于病原菌、病毒的检测及鉴定，还可对DNA 进行定量分析；该方法用于单核苷酸多态性分型更灵敏 准确，不仅能够促进多基因性疾病的研究，还能决定临 床药物的使用及用药量。目前，已建立起多种病原菌、 病毒的LAMP 检测法。
流行性乙型脑炎病毒的检测：杜鹃等建立了流行性乙 型脑炎病毒一步法 RT-LAMP 检测方法，对 GenBank 中登录的25 株JEV基因序列进行分析，设计该基因保 守区域的RT-LAMP引物，其中包括2条外引物F3／B3， 2 条 内 引 物 FIP ／ BIP 和 2 条 环 引 物 FLP ／ BLP 。 在 LAMP反应体系中加入逆转录酶和RNA 模板，65℃水 浴60 min，反应可一步完成。
犬细小病毒的检测：杨慧等建立了犬细小病毒LAMP 检测方法，选取犬细小病毒VP2 基因保守区设计引物， 包括2 条外引物F3、B3，2 条内引物FIP、BIP 和2 条 加快反应速度的环引物LF、LB 等6 条引物。反应45 min 的反应液进行凝胶电泳即能出现特异性条带。
LAMP反应引物与对应模板区域
第 1 步：内引物 FIP 的 F2 与其模板的互补序 列 F2c 结 合 ， 在 Bst DNA 聚合酶作用下， 从 F2 的 3′ 末 端 开 始 启 动DNA 合成，合成一 条以 FIP 为起始的新的 DNA 单链，并与模板 链结合形成新的双链 DNA 。而原 DNA 双链 中与模板链互补的非 模板链将被取代而游 离于反应液中。
第 2 步 ： 原 合 成的以 FIP 为起 始的 DNA 单 链 被置换而脱离， 成为单链 DNA ， 其在 5′末端 F1c 和 F1 区 发 生 自 我碱基配对， 形成茎环状结 构。
第3步：引物BIP的B2与模板 链 B2c 区互补配对，合成以 BIP 为 起始的新链，并与模 板链互补形成DNA双链。同 时， F 端的环状结构将被打 开，外引物 B3 与模板上 B3c 杂交后，以其 3 末端为起点 也开始合成新链，并使 BIP 为起始的DNA单链从模板链 上脱离下来，形成以 FIP 和 BIP为两端的单链。 整条链呈现哑铃状结构，此 结构即为LAMP的基础结构.
Fra Baidu bibliotek
针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’ 端的F3c、F2c和Flc区 以及5’ 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。 LAMP反应的开始阶段四条引物都被使用，但在循环阶段则只有内引 物被使用。 FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成， F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5’端的Flc区域序列 相同。 F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组成，并与靶 基因的F3c区域互补。 BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C和B2区域 组成，B2区与靶基因3’端的B2c区域互补，B1C域与靶基因5’端的Blc 区域序列相同。 B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3区域组成， 和靶基因的B3c区域互补。
反应结束后，对扩增产物常进行焦磷酸镁沉淀检测（浊度 检测）、荧光检测、凝胶电泳检测、实时检测。 浊度检测：在LAMP反应过程中，会产生一种叫焦磷酸镁的 衍生物。由于LAMP能产生大量的扩增产物，衍生物的产量 也会大增，于是呈现出白色浑浊。因此，通过观察白色浑浊 的有无，可验证是否有靶基因存在。 荧光检测：钙黄绿素（螯合剂）与试剂中的锰离子结合后 处于淬灭状态。扩增反应的副产物焦磷酸离子与锰离子结合 释放钙黄绿素，使钙黄绿素的淬灭状态解除，发出黄绿色荧 光。反应后加荧光染料法的优点是灵敏度较高，在直接观察 不能准确判断结果时，加入荧光染料可增加其可视性，提高 判断的准确度
LAMP克服了传统PCR反应需要通过反复热变性获得单链模板的缺点，避 免了反复升降温的过程，实现了恒温条件下的连续快速扩增，具有更高的 灵敏度和扩增效率。 操作简单：只需一个水浴锅 快速高效：不需要预先的双链DNA热变性．避免了温度循环而造成 的时 间损失 特异性强：针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区域中任何区 域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异性极高。 高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数量级的差异。 缺点：由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度最好在300 bp以内。 >500 bp则较难扩增。故不能进行长链DNA的扩增。灵敏度高易造成假阳 性结果。
2015307360 吴祖雄
定义：针对靶基因的 6个区域设计4种特异引物，在链 置换 DNA 聚合酶 (Bst DNA polymerase) 的作用下， 60--65℃恒温扩增，15-60分钟左右即可实现 10^9～ 10^10倍的核酸扩增。
①扩增目的片段时依赖的是一种具有链置换特性的 Bst DNA聚合酶 ②需四条能够识别靶序列六个特异区域的引物 ③LAMP法并不需要对双链DNA进行预变性及进行温度 循环
LAMP可用于病原菌、病毒的检测及鉴定，还可对DNA 进行定量分析；该方法用于单核苷酸多态性分型更灵敏 准确，不仅能够促进多基因性疾病的研究，还能决定临 床药物的使用及用药量。目前，已建立起多种病原菌、 病毒的LAMP 检测法。
流行性乙型脑炎病毒的检测：杜鹃等建立了流行性乙 型脑炎病毒一步法 RT-LAMP 检测方法，对 GenBank 中登录的25 株JEV基因序列进行分析，设计该基因保 守区域的RT-LAMP引物，其中包括2条外引物F3／B3， 2 条 内 引 物 FIP ／ BIP 和 2 条 环 引 物 FLP ／ BLP 。 在 LAMP反应体系中加入逆转录酶和RNA 模板，65℃水 浴60 min，反应可一步完成。
犬细小病毒的检测：杨慧等建立了犬细小病毒LAMP 检测方法，选取犬细小病毒VP2 基因保守区设计引物， 包括2 条外引物F3、B3，2 条内引物FIP、BIP 和2 条 加快反应速度的环引物LF、LB 等6 条引物。反应45 min 的反应液进行凝胶电泳即能出现特异性条带。
LAMP反应引物与对应模板区域
第 1 步：内引物 FIP 的 F2 与其模板的互补序 列 F2c 结 合 ， 在 Bst DNA 聚合酶作用下， 从 F2 的 3′ 末 端 开 始 启 动DNA 合成，合成一 条以 FIP 为起始的新的 DNA 单链，并与模板 链结合形成新的双链 DNA 。而原 DNA 双链 中与模板链互补的非 模板链将被取代而游 离于反应液中。
第 2 步 ： 原 合 成的以 FIP 为起 始的 DNA 单 链 被置换而脱离， 成为单链 DNA ， 其在 5′末端 F1c 和 F1 区 发 生 自 我碱基配对， 形成茎环状结 构。
第3步：引物BIP的B2与模板 链 B2c 区互补配对，合成以 BIP 为 起始的新链，并与模 板链互补形成DNA双链。同 时， F 端的环状结构将被打 开，外引物 B3 与模板上 B3c 杂交后，以其 3 末端为起点 也开始合成新链，并使 BIP 为起始的DNA单链从模板链 上脱离下来，形成以 FIP 和 BIP为两端的单链。 整条链呈现哑铃状结构，此 结构即为LAMP的基础结构.
Fra Baidu bibliotek
针对靶基因的六个不同的区域，基于靶基因3’ 端的F3c、F2c和Flc区 以及5’ 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种引物。 LAMP反应的开始阶段四条引物都被使用，但在循环阶段则只有内引 物被使用。 FIP(Forward Inner Primer)：上游内部引物，由F2区和F1C区域组成， F2区与靶基因3’端的F2c区域互补，F1C区与靶基因5’端的Flc区域序列 相同。 F3引物：上游外部引物(Forward Outer Primer)，由F3区组成，并与靶 基因的F3c区域互补。 BIP引物：下游内部引物(Backward Inner Primer )，由B1C和B2区域 组成，B2区与靶基因3’端的B2c区域互补，B1C域与靶基因5’端的Blc 区域序列相同。 B3引物：下游外部引物(Backward Outer Primer )，由B3区域组成， 和靶基因的B3c区域互补。
反应结束后，对扩增产物常进行焦磷酸镁沉淀检测（浊度 检测）、荧光检测、凝胶电泳检测、实时检测。 浊度检测：在LAMP反应过程中，会产生一种叫焦磷酸镁的 衍生物。由于LAMP能产生大量的扩增产物，衍生物的产量 也会大增，于是呈现出白色浑浊。因此，通过观察白色浑浊 的有无，可验证是否有靶基因存在。 荧光检测：钙黄绿素（螯合剂）与试剂中的锰离子结合后 处于淬灭状态。扩增反应的副产物焦磷酸离子与锰离子结合 释放钙黄绿素，使钙黄绿素的淬灭状态解除，发出黄绿色荧 光。反应后加荧光染料法的优点是灵敏度较高，在直接观察 不能准确判断结果时，加入荧光染料可增加其可视性，提高 判断的准确度
LAMP克服了传统PCR反应需要通过反复热变性获得单链模板的缺点，避 免了反复升降温的过程，实现了恒温条件下的连续快速扩增，具有更高的 灵敏度和扩增效率。 操作简单：只需一个水浴锅 快速高效：不需要预先的双链DNA热变性．避免了温度循环而造成 的时 间损失 特异性强：针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区域中任何区 域与引物不匹配均不能进行核酸扩增。故其特异性极高。 高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数量级的差异。 缺点：由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度最好在300 bp以内。 >500 bp则较难扩增。故不能进行长链DNA的扩增。灵敏度高易造成假阳 性结果。