代谢组学及其研究方法和应用

[作者单位]南京军区南京总医院解放军肾脏病研究所

(南京,210002)

代谢组学及其研究方法和应用

陈慧梅　综述　刘志红　审校

关键词　代谢组学　核磁共振　质谱　代谢产物 代谢组学是继基因组学、转录组学和蛋白质组

学之后,系统生物学的重要组成领域[1]

。代谢组学的研究可以追溯至上世纪80年代。1985年,N ichols on 研究小组利用核磁共振(NMR )技术分析大鼠的尿液,意识到这可能是生命科学研究的巨大

突破[2]

,并于1999年,提出了代谢组学(metabonom 2ics )的概念。代谢组指的是“一个细胞、组织或器官中,所有代谢组分的集合,尤其指小分子物质”,而代谢组学则是一门“在新陈代谢的动态进程中,系统研究代谢产物的变化规律,揭示机体生命活动代谢本质”的科学。

细胞内的生命活动大多发生于代谢层面,如细胞信号释放、能量传递、细胞间通信等,故代谢组学被认为是“组学”研究的最终方向。基因与蛋白质的表达紧密相连,代谢物则更多地反映了细胞所处的环境,如营养状态,药物和环境污染等影响。正如B illy David 所言:“基因组学和蛋白质组学告诉你可能发生什么,而代谢组学则告诉你已经发生了什

么”[3]

。其具体的内容:

11基因组学研究的是生物体在一定的病理生理条件下,基因表达谱的改变。但“沉默基因”及基因之间的互相调控,使得基因的“开”、“关”与生物学效应并无直接联系。而且不能与生物体作用的靶位点直接联系。

21蛋白质组学主要是针对细胞蛋白质的变化,进行半定量测定。蛋白质是生理功能的执行者,研究它可以很大程度地揭示病理生理机制,发现疾病的生物标志。但蛋白质组学也存在信号通路蛋白相互影响,靶位点难以定位等缺点,而且不能动态、实时的反映整体信息。

31代谢组学关注的是各种代谢路径底物和产

物的小分子代谢物(MW <1K D ),反映细胞或组织在外界刺激或是遗传修饰下代谢应答的变化,包括糖、脂质、氨基酸、维生素等。特别是基于NMR 技术的研究方法,并不需要进行样品的提取、纯化,可以无损伤地监测组织代谢表达谱的改变,动态地评估代谢信息。并在此基础上,定位相应的靶组织、作用过程以及生物学标志。代谢组学研究技术平台

代谢组学研究的技术平台包括以下几个部分:前期的样品制备,中期的代谢产物检测、分析与鉴定以及后期的数据分析与模型建立。

前期　代谢组学研究常用的检测技术,一般不需要对标本行特别的分离、纯化等。但离体条件下,细胞或组织内的代谢状态可迅速改变,代谢物的质与量亦随之变化,为正确反映在体的真实信息,须立即阻断内在酶的活性。最为常用的是冰冻/液氮降温法及冷冻、干燥的保存技术[4]

,尽管如此,细胞间仍始终有一低水平的代谢活动,需尽量避免氧化等活化因素。

中期　代谢产物的检测、分析与鉴定是代谢组学技术的核心部分,最常用的是NMR 及质谱(MS )两种。

核磁共振技术　是利用高磁场中原子核对射频辐射的吸收光谱鉴定化合物结构的分析技术,生命

科学领域中常用的是氢谱(1H NMR )、碳谱(13

C

NMR )及磷谱(31

P NMR )三种。可用于体液或组织提取液和活体分析两大类。

常用的是体液分析研究。以氢谱(1

H NMR )为例[5]

,将准备好的生物标本(包括各种体液或组织

提取液),直接上样检测即可。所得的1

H NMR 谱峰与样品中各化合物的氢原子对应,根据一定的规则或与标准氢谱比照可以直接鉴定出代谢物的化学成分,信号的相对强弱则反映了各成分的相对含量

(图1)。不同样品的代谢物图谱有其特质性,类似

样品的“指纹”一样;对这种特质性进行区分、鉴定,

被称为“代谢指纹分析(metabolic finger p rint analy 2sis )”,帮助找出机体代谢的共性与个性

。

图1　利用核磁共振(N M R)技术检测不同组织的谱图

A 肾乳头组织;

B 肾皮质组织　两组间各自的特征性波明显

不同的差别

NMR 还能够对活体内外的非损伤组织、器官进

行研究。以心脏的磷谱研究为例[6]

,将预处理的体外灌流心脏直接置于检测区,持续观察低氧干预下31P NMR 谱峰的改变情况,发现低氧状况下,P

3+和Mg 2+

的含量增加,并随低氧的延长而加深、加重。这种分析器官或组织中某一代谢物或组合随时间变化的情况,称之为“代谢轮廓分析(metabolic p r ofi 2ling analysis )”,观察特定干预的动态系统中,找出机体代谢变化的规律。

NMR 技术在代谢组学中的应用越来越广泛,它具有如下优点:①无损伤性,不破坏样品的结构和性质;②可在一定的温度和缓冲范围内进行生理条件或接近生理条件的实验;③与外界特定干预相结合,研究动态系统中机体化学交换、运动等代谢产物的变化规律;④实验方法灵活多样。但仪器价格及维护费用昂贵限制了该技术的进一步普及。

质谱技术　是将离子化的原子、分子或是分子碎片按质量或是质荷比(m /e )大小顺序排列成图谱,并在此基础上,进行各种无机物、有机物的定性或定量分析。新的离子化技术则使质谱技术的灵敏度和准确度均有很大程度的提高。

将预处理的体液或是组织(根据实验需要,可将组织行甲醇除蛋白、庚烷除脂肪及冻干等处理),加至质谱仪,经历汽化,离子化、加速分离及检测分析后即可得出相应代谢产物或是代谢组的图谱(图

2)。图谱中每个峰值对应着相应的分子量[7]

,结合

进一步的检测分析可以部分鉴定出化学成分以及半

定量关系。不同组别的质谱图存在差异(“代谢指纹”分析),加以区别、鉴定,亦有助于研究代谢的变

化规律及标志性代谢产物。

图2　正常尿液质谱分析图

N MR 技术与MS 技术相比,各有其优缺点,需要

在研究中灵活选用。总体而言,N MR 技术应用的更

为广泛。此外,根据代谢组学的研究需要,还常用于其他的一些分析技术,如气相色谱(G C ),高效液相色谱仪(HP LC ),高效毛细管电泳(HPCE )等。它们往往与N MR 或MS 技术联用,进一步增加其灵敏性。但不容忽视的是,随着分析手段更新,敏感性及分辨率提高,“假阳性”的概率也就越大,可能是仪器技术方法固有的,亦或是数据分析过程中产生的。

后期　代谢组学研究的后期需借助于生物信息学平台。它往往借助于一定的软件,联合多种数据分析技术,将多维、分散的数据进行总结、分类及判别分析,发现数据间的定性、定量关系,解读数据中蕴藏的生物学意义,阐述其与机体代谢的关系。如果说分析技术在我们面前打开了“一扇门”,正确的数据分析方

法和模型建立便是“找到宝藏”的钥匙[8]

。

主成分分析法(PCA )是最常用的分析方法[9]

。其将分散于一组变量上的信息集中于几个综合指标(PC )上,如糖代谢、脂质代谢、氨基酸代谢等,利用主成分描述机体代谢的变化情况,发挥了降维分析的作用,避免淹没于大量数据中(图3)。其他的模式识别技术,如聚类分析、辨别式功能分析、最小二乘法投影法等在代谢组学研究中亦有其重要的地位。现实情况下,代谢组学的数据更为复杂,特别是NMR 对病理生理过程的研究,将代谢物的表达谱与时间相联系,分析时更加困难,需要借助复杂的模型或是专家系统进行分析(在应用的部分,结合具体研究简单加以阐述)。已有研究小组建立了包括酵母糖酵解在内的一系列代谢模型,并在仿真器上开展代谢仿真等研究工作。