副溶血性弧菌检验

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是广泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物和鱼贝类中的海洋性细菌，为海产食品引起急性胃肠炎的重要病原菌之一，尤其是在夏秋季节的沿海地区，经常由于食用带有大量副溶血性弧菌的海产食品，引起爆发性食物中毒。在非沿海地区，因食用此菌污染的食品而引起中毒者亦时有发生。为保障食品卫生质量和食用安全，根据副溶血性弧菌的特性，进行下列检验，以便鉴别诊断。

第一节副溶血性弧菌标准的检验方法

一、检验方法

（一）操作步骤

1. 分离培养：首先称取样品25g，加225mL3.5％灭菌盐水，用均质器打碎或用乳钵磨碎，接种氯化钠琼脂平板和嗜盐性琼脂平板各一个，同时取10mL加入100mL增菌液中，放37℃8~16h培养后，涂上述平板进行分离，37℃培养18~24h取出观察，挑取可疑菌落，转种3.5％氯化钠三糖铁斜面，37℃、24h观察结果。

2. 涂片镜检：将三糖铁培养基上反应可疑者即底层变黄（葡萄糖产酸不产气）、上层斜面不变（乳糖、蔗糖不分解）、有动力、不产生硫化氢，进行革兰氏染色镜检形态。

3. 嗜盐性试验：将上述可疑培养物分别接种不同含量的盐胨水（0％，3％，7％，10％）于37℃24h培养后观察生长情况，在无盐和10％盐的胨水中不生长，在3％和7％盐的胨水中生长良好者，继续进行下列有关试验。

4. 生化试验：分别接种下列各类生化培养基，葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基红、靛基质、V-P，赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、硫化氢及溶血性试验，放37℃培养，除V-P、靛基质和甲基红试验培养48h后加试剂观察外，其他均在24h观察结果。

5. 动物试验：将上述符合各类反应的副溶血性弧菌，接种3.5％氯化钠胨水，经37℃、16~18h培养后，小鼠腹腔注射0.3mL，观察2~3d，将死亡小鼠进行解剖作分离培养。

（二）检验程序

图6-1 副溶血性弧菌检验程序

二、结果分析判定及注意事项

（一）样品处理

采样时应注意首选准备好灭菌用具及容器，以无菌手续取有代表性的样品，样品必须尽快送检，不宜存放时间过长，副溶血性弧菌在适宜温度下繁殖较快，但不适于低温生存，在寒冷的情况下容易死亡，防止待检材料冷冻，以免影响检验结果。

对采取的样品有时因受存放条件的影响（如低温冷冻或干燥时间过长等原因），使菌体处于受伤状态，故需对此类可疑食品或可疑中毒材料进行增菌培养，但应注意为有利于细菌恢复，不宜选用抑制性较强的培养基，否则影响细菌生长。

样品经增菌8~16h后，转种平板进行分离，挑选可疑菌落，接种于含有3.5％盐的三糖铁培养基，此时挑选数目不应少于5个，尤其夏季海产食品混放，相互污染严重，时有不同型别的大量细菌存在，以防漏检。（二）形态与染色

为革兰氏阴性无芽胞杆菌，易呈多形态，有棒状、弧状、卵圆状、球状、丝状等，排列不规则，多数散在，偶而有成对排列，一般大小为0.3~0.7ｕm×1~2ｕm，单端一根鞭毛，有动力，运动活泼，两端浓染，在固

0.01％结晶紫溶液5mL

蒸馏水1000mL

pH9.0

制法：除结晶紫外其他按上述成分配好，加热溶解，约加3％氢氧化钾溶液4.5mL，校正pH，加热煮沸，过滤，再加入结晶紫溶液，混合分装试管，121℃高压灭菌15min。

（二）氯化钠蔗糖琼脂

成分：蛋白胨10g

牛肉膏10g

氯化钠50g

蔗糖10g

琼脂18g

0.2％溴麝香草酚蓝溶液20mL

蒸馏水1000mL

pH7.8

制法：将牛肉膏、蛋白胨及氯化钠溶解于蒸馏水中，校正pH，加入琼脂，加热溶解，过滤，加入指示剂，分装烧瓶100mL，121℃高压灭菌15min备用。临用前在100mL培养基内加入蔗糖1g，加热溶化，冷至50℃倾注平板。

（三）嗜盐菌选择性培养基

成分：蛋白胨20g

氯化钠40g

琼脂17g

0.01％结晶紫溶液5mL

蒸馏水1000mL

pH8.7

制法：除结晶紫和琼脂外，其他按上述成分配好，校正pH，加入琼脂，加热溶解，再加结晶紫溶液，分装烧瓶，每瓶100mL。

（四）3.5％氯化钠三糖铁琼脂

成分：蛋白胨20g

牛肉膏5g

乳糖10g

蔗糖10g

葡萄糖1g

氯化钠35g

硫酸亚铁铵0.2g

硫代硫酸钠0.2g

琼脂12g

酚红0.025g

蒸馏水1000mL

pH7.4

制法：将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH，加入琼脂，加热煮沸使琼脂溶化，加入0.2％

酚红溶液12.5mL，摇匀，分装试管，121℃高压灭菌15min，放置高层斜面备用。

（五）氯化钠血琼脂（我妻氏培养基）

成分：酵母膏3g

蛋白胨10g

氯化钠70g

磷酸氢二钠 5g

甘露醇10g

结晶紫0.001g

琼脂15g

蒸馏水1000mL

制法：调pH8.0，加热30min（不必高压），待冷至45℃左右时，加入新鲜人或兔血（5％~10％），混合均匀，倾注平皿。

（六）嗜盐性试验培养基

成分：蛋白胨2g

氯化钠按不同量加入

蒸馏水100mL

pH7.7

（七）3.5％氯化钠生化试验培养基

成分：牛肉膏5g

蛋白胨10g

氯化钠35g

磷酸氢二钠2g

0.2％溴麝香草酚蓝溶液12mL

蒸馏水1000mL

pH7.7

制法：将上述成分配好后，根据所需的糖发酵管分别加入各种糖类，葡萄糖发酵管可按0.5％葡萄糖加入后，分装有小倒管的试管内，121℃高压灭菌15min。其他培养基可分装为每瓶100mL，121℃高压灭菌15min，另将各糖类分别配好10％溶液，同时高压灭菌后，取5mL糖液，加入100mL培养基内，以无菌操作分装小试管。

（八）葡萄糖食盐胨水（MR-VP试验用）

成分：多胨5g

葡萄糖5g

磷酸氢二钾5g

氯化钠30g

制法：加入1000mL蒸馏水，振摇加热，使全部溶解，冷却后分装小试管，121℃高压灭菌15min。

（九）食盐胨水（靛基质试验用）

成分：蛋白胨20g

氯化钠30g

蒸馏水1000mL

pH7.4