奥美拉唑促小鼠胃癌发生的机制研究_何伟
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Study on the mechanism of omeprazole in promoting the development of gastric cancer in mice
HE Wei1 ，QI Dong-jiang1 ，XU A-man1，2 ，et al （ 1． Department of General Surgerຫໍສະໝຸດ Baidu，The Fourth Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei，
摘要： 目的 研究奥美拉唑（ omeprazole，ome） 是否会增加小鼠胃癌的发病率并探讨其可能存在的机制。方法 实验分为单纯 对照组、ome 低剂量组（ 6 mg·kg －1 ） 、ome 高剂量组（ 30 mg·kg －1 ） 、甲基硝基亚硝基胍（ N-methyl-N＇-nitro-N-nitrosoguanidine， MNNG） 组、MNNG + ome 低剂量组、MNNG + ome 高剂量组。MNNG 加入饮用水中（ 100 mg·L －1 ） 小鼠自由饮用。每组 7 只小 鼠，常规饲养 24 周后处死小鼠收集标本并计算小鼠脾质量指数，HE 染色观察小鼠胃病理形态学改变，ELISA 法检测小鼠血清 及脾脏中酸性磷酸酶（ acid phosphatase，ACP） 、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（ N-acetyl-β-D-glucosaminidase，NAG） 含量； Western Blotting 检测小鼠胃 p21、p53、mTOＲ 表达。结果 ome 组与对照组相比及 MNNG 组与 ome + 组相比，小鼠脾质量指数、血清及 脾脏中溶酶体酶活性明显下降； 与 MNNG 组相比 ome + 组小鼠胃癌发生率明显增加，尤其是 MNNG + ome 高剂量组，两者差异 有统计学意义（ P ＜ 0． 05） ； 和对照组相比，实验组 p53 表达增加，p21 表达减少，mTOＲ 表达减少，差异均有统计学意义（ P ＜ 0． 05） 。结论 ome 可以促进胃癌发生，其机制可能是和抑制小鼠体内溶酶体及其水解酶的活性，从而降低小鼠免疫功能 有关。 关键词： 胃肿瘤； 奥美拉唑； 溶酶体； 酸性磷酸酶； 印迹法，蛋白质； 小鼠，基因敲除 doi： 10． 3969 / j． issn． 1009 － 6469． 2016． 06． 008
通信作者： 徐阿曼，男，主任医师，硕士生导师，研究方向： 胃肠肿瘤，E-mail： xuaman166@ sina． com
安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2016 Jun，20（ 6）
·1055·
胃癌是人类最常见的消化道恶性肿瘤之一，每 年胃癌死亡率约占癌症相关死亡的 10% ，仅次于肺 癌［1］。我国一直是胃癌高发地区，其发病率在我国 肿瘤中居第二位，死亡率仅次于肺癌和肝癌［2］。20 世纪 90 年代（ 1994 年） 世界卫生组织 / 国际癌症研 究机 构 （ WHO / IAＲC） 将 幽 门 螺 杆 菌 （ Helicobacter pylori，Hp） 定为Ⅰ类致癌原，随后根除 Hp 的药物大 量使用于临床，尤其是以 ome 为代表性药物的质子 泵抑制剂（ proton pump inhibitors，PPIs） 。
PPIs 是一种非常有效的药物，其作用机制是阻 断胃壁细胞分泌管上 H + / K + － ATP 酶的活性从而 阻断任何刺激引起的胃酸分泌，但会引起胃壁细胞 增生、腺 囊 肿、高 胃 泌 素 血 症 及 胃 底 腺 息 肉 等 不 良 反应。对于长期使用 PPIs 是否会增加胃癌发病率 仍缺乏充分的实验室证据及临床病例支持。本研 究通过不同剂量 ome 长期给小鼠灌胃及 ome 与甲 基硝基亚硝基胍（ MNNG） 合用时对小鼠胃黏膜的影 响，并观察 ome 是否会增加小鼠胃癌发病率并对其 机制进 行 探 索，从 而 为 临 床 合 理 用 药 提 供 理 论 依据。 1 实验动物与试剂
Anhui 230032，China； 2． Department of Gastrointestinal Surgery，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei，Anhui 230022，China）
Abstract： Objective To investigate if oral omeprazole（ ome） will increase the incidence of gastric cancer in mice and the possible mechanism． Methods Mice were divided into 6 groups，with seven mice in each group，including control group，low-dose ome group，high-dose ome group，N-methyl-N＇-nitro-N-nitrosoguanidine （ MNNG） group，MNNG + low-dose ome group （ 6 mg· kg － 1 ） ， and MNNG + high-dose ome group （ 30 mg·kg － 1 ） ． The mice were administrated with drinking water containing MNNG． The mice were raised in a routine way for 24 weeks． After that the mice were sacrificed to collect samples and calculate the mice spleen index． HE staining of the mice stomach was applied to exam the histological changes． Serum and spleen concentrations of acid phosphatase （ ACP） and N-acetyl-β-D-glucosaminidase （ NAG） were detected by ELISA． And the expression levels of p21，p53 and mTor in the mouse stomach were detected by Western Blotting． Ｒesults In the comparison of the ome group with the control group and the MNNG group with the ome + group，mice spleen weight indexes in the ome group and the ome + group decreased significantly． Meanwhile，mice serum and spleen lysosomal enzyme levels also decreased significantly． Compared with MNNG group，the incidence of gastric cancer in the ome + group was increased significantly． especially in the MNNG + ome high-dose group，． and the difference was statistically significant （ P ＜ 0． 05） ． Compared with the control group，the expressions of p53 in the experimental group was increased，the expressions of p21 decreased，and the expressions of mTOＲ also decreased （ P ＜ 0． 05 ） ． Conclusions Ome can promote gastric carcinogenesis in mice，and its mechanism may be through the inhibition of lysosomal hydrolase enzyme and its fuction in mice，thereby reducing the immune fuction in these mice． Key words： Stomach neoplasms； Omeprazole； Lysosomes； Acid phosphatase； Blotting，western； Mice，knockout
·1054·
安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2016 Jun，20（ 6）
奥美拉唑促小鼠胃癌发生的机制研究
何 伟1 ，齐东江1 ，徐阿曼1，2 ，袁 笑1 ，陆 震1 （ 1． 安徽医科大学第四附属医院普外科，安徽 合肥 230032； 2． 安徽医科大学第一附属医院胃肠外科一病区，安徽 合肥 230022）
清洁级 KM 小鼠，雄性，体质量 24 ～ 26 g，共 42 只，由安徽医科大学实验动物中心提供。奥美拉唑 肠溶 片 购 自 山 东 新 时 代 药 业 有 限 公 司，批 号： 009131003。MNNG 购自日本 TCI 公司，于 4 ℃ 冰箱 保存。N-乙酰-β-D-氨基 葡 萄 糖 苷 酶 （ NAG） ELISA 检测试剂盒、酸性磷酸酶（ ACP） ELISA 检测试剂盒 购自百奥莱博； 日立 7020 全自动生化分析仪； SpectraMax 190 酶标仪； JEDＲ801D 形态学图像分析系统 Version6． 0； NOVA 型切片机； 美国 Bio-Ｒad 电泳仪。 2 方法 2． 1 胃癌动物模型建立与分组 小鼠饲养于安徽 医科大学药理教研室动物中心，聚丙烯笼内标准条 件下饲养，温度维持在 24 ℃ ，自动进食饮水。所有 动物随机分为对 照 组、ome 低 剂 量 组、ome 高 剂 量 组、MNNG 组、MNNG + ome 低剂量组（ ome 低 + ） 、 MNNG + ome 高剂量组（ ome 高 + ） 六组，每组 7 只。 后三组饮用水中加入 MNNG 100 mg·L － 1 ，小鼠自 由饮用。ome、ome 低 + 组及 ome 高 + 组小鼠每天 给予 ome 灌胃，低剂量为（ 6 mg·kg － 1 ，按体质量 60 kg 成人每日服用 40 mg ome 为标准，按照小鼠与人 体药 物 剂 量 换 算 公 式 计 算 ） 、高 剂 量 为 30 mg · kg － 1 。动物常规饲养，每周称量体质量一次，24 周 后处死小鼠，收取标本，处死前小鼠禁食 24 h。 2． 2 小鼠脾质量指数测定 小鼠处死前称量小鼠
体质量。脱颈椎处死后剖腹迅速取出小鼠脾脏，分 析天平称重。计算脾质量指数，即脾质量指数 = 脾 脏质量（ mg） / 体质量（ g） 。 2． 3 小鼠胃组织病理形态学观察 用 2． 5% 戊巴 比妥钠 （ 2 mL · kg － 1 ） 腹腔注射麻醉动物后取血。 脱颈椎处死小鼠后迅速打开小鼠腹腔，取出胃 组 织，沿胃大弯侧切开，0． 9% NaCl 清洗三次并把标本 固定，肉眼观察胃黏膜大体形态变化。每只小鼠于 胃底、胃体及胃窦各取两块组织固定于 10% 中性甲 醛溶液，固定 24 h 后，组织脱水、浸蜡、包埋、切片， 行行苏木精-伊红（ HE） 染色，光电下观察胃组织病 理形态学改变。胃黏膜病理变化由病理科医师双 盲读片。 2． 4 小鼠血清及组织中 ACP 及 NAG 含量测定 采用 ELISA 法测定血清及组织中 ACP 和 NAG 含 量。实验步骤严格按照操作说明书操作。并在 450 nm 处测定吸光度值。 2． 5 蛋白质印迹法（ Western Blotting） 随机选取 每组小鼠 5 只，将蛋白从小鼠前胃组织中提取，BCA 法定量蛋白 （ BCA 蛋白检测试剂盒购自中国碧云 天） ，SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白，电泳后将蛋白 转移至聚偏氟乙烯（ PVDF） 膜上，使用含 5% 脱脂奶 的 0． 3% 吐温 20Tris 缓冲盐溶液（ TBST） 封闭 1 h， 分别用兔抗小鼠 p21 抗体（ 购自英国 Abcam 公司） 、 兔抗小鼠 p53 抗体、兔抗小鼠 mTOＲ 抗体（ 购自美 国 Affinity Biosciences 公司） 孵育过夜，TBST 洗三次 后使用羊 抗 兔 IgG 抗 体 （ 购 自 美 国 Affinity Biosciences 公 司 ） 孵 育 2 h，增 强 化 学 发 光 （ Enhanced Chemiluminescence，ECL） 法观察蛋白表达水平，使 用 ImageJ 软件分析结果，计算相对灰度值。 2． 6 统计学方法 所有计量资料以 x ± s 表示，多 组间定量数据的比较采用单因素方差分析（ one-way ANOVA） ，多组之间两两比较采用 SNK-Q 检验的方 法，多组定性数据得比较采用确切概率法，以 P ＜ 0． 05为差异有统计学意义。 3 结果 3． 1 小鼠一般情况 MNNG 组与 ome 低 + 和 ome 高 + 比较小鼠明显不活泼，毛发光泽度较差，食量 减少，但小鼠平均体质量较后两组高，这可能和 ome 可以改善 MNNG 对小鼠的消化道 症 状 相 关。ome 组和对照组比较差异无统计学意义。 3． 2 ome 对小鼠脾质量指数的影响 各组小鼠脾 质量指数见表 1。长期使用 ome 均可导致小鼠脾 质量指数下降。 与 对 照 组 相 比，ome 低 剂 量 组 小 鼠脾质 量 指 数 下 降，但 差 异 无 统 计 学 意 义，ome
HE Wei1 ，QI Dong-jiang1 ，XU A-man1，2 ，et al （ 1． Department of General Surgerຫໍສະໝຸດ Baidu，The Fourth Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei，
摘要： 目的 研究奥美拉唑（ omeprazole，ome） 是否会增加小鼠胃癌的发病率并探讨其可能存在的机制。方法 实验分为单纯 对照组、ome 低剂量组（ 6 mg·kg －1 ） 、ome 高剂量组（ 30 mg·kg －1 ） 、甲基硝基亚硝基胍（ N-methyl-N＇-nitro-N-nitrosoguanidine， MNNG） 组、MNNG + ome 低剂量组、MNNG + ome 高剂量组。MNNG 加入饮用水中（ 100 mg·L －1 ） 小鼠自由饮用。每组 7 只小 鼠，常规饲养 24 周后处死小鼠收集标本并计算小鼠脾质量指数，HE 染色观察小鼠胃病理形态学改变，ELISA 法检测小鼠血清 及脾脏中酸性磷酸酶（ acid phosphatase，ACP） 、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（ N-acetyl-β-D-glucosaminidase，NAG） 含量； Western Blotting 检测小鼠胃 p21、p53、mTOＲ 表达。结果 ome 组与对照组相比及 MNNG 组与 ome + 组相比，小鼠脾质量指数、血清及 脾脏中溶酶体酶活性明显下降； 与 MNNG 组相比 ome + 组小鼠胃癌发生率明显增加，尤其是 MNNG + ome 高剂量组，两者差异 有统计学意义（ P ＜ 0． 05） ； 和对照组相比，实验组 p53 表达增加，p21 表达减少，mTOＲ 表达减少，差异均有统计学意义（ P ＜ 0． 05） 。结论 ome 可以促进胃癌发生，其机制可能是和抑制小鼠体内溶酶体及其水解酶的活性，从而降低小鼠免疫功能 有关。 关键词： 胃肿瘤； 奥美拉唑； 溶酶体； 酸性磷酸酶； 印迹法，蛋白质； 小鼠，基因敲除 doi： 10． 3969 / j． issn． 1009 － 6469． 2016． 06． 008
通信作者： 徐阿曼，男，主任医师，硕士生导师，研究方向： 胃肠肿瘤，E-mail： xuaman166@ sina． com
安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2016 Jun，20（ 6）
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胃癌是人类最常见的消化道恶性肿瘤之一，每 年胃癌死亡率约占癌症相关死亡的 10% ，仅次于肺 癌［1］。我国一直是胃癌高发地区，其发病率在我国 肿瘤中居第二位，死亡率仅次于肺癌和肝癌［2］。20 世纪 90 年代（ 1994 年） 世界卫生组织 / 国际癌症研 究机 构 （ WHO / IAＲC） 将 幽 门 螺 杆 菌 （ Helicobacter pylori，Hp） 定为Ⅰ类致癌原，随后根除 Hp 的药物大 量使用于临床，尤其是以 ome 为代表性药物的质子 泵抑制剂（ proton pump inhibitors，PPIs） 。
PPIs 是一种非常有效的药物，其作用机制是阻 断胃壁细胞分泌管上 H + / K + － ATP 酶的活性从而 阻断任何刺激引起的胃酸分泌，但会引起胃壁细胞 增生、腺 囊 肿、高 胃 泌 素 血 症 及 胃 底 腺 息 肉 等 不 良 反应。对于长期使用 PPIs 是否会增加胃癌发病率 仍缺乏充分的实验室证据及临床病例支持。本研 究通过不同剂量 ome 长期给小鼠灌胃及 ome 与甲 基硝基亚硝基胍（ MNNG） 合用时对小鼠胃黏膜的影 响，并观察 ome 是否会增加小鼠胃癌发病率并对其 机制进 行 探 索，从 而 为 临 床 合 理 用 药 提 供 理 论 依据。 1 实验动物与试剂
Anhui 230032，China； 2． Department of Gastrointestinal Surgery，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei，Anhui 230022，China）
Abstract： Objective To investigate if oral omeprazole（ ome） will increase the incidence of gastric cancer in mice and the possible mechanism． Methods Mice were divided into 6 groups，with seven mice in each group，including control group，low-dose ome group，high-dose ome group，N-methyl-N＇-nitro-N-nitrosoguanidine （ MNNG） group，MNNG + low-dose ome group （ 6 mg· kg － 1 ） ， and MNNG + high-dose ome group （ 30 mg·kg － 1 ） ． The mice were administrated with drinking water containing MNNG． The mice were raised in a routine way for 24 weeks． After that the mice were sacrificed to collect samples and calculate the mice spleen index． HE staining of the mice stomach was applied to exam the histological changes． Serum and spleen concentrations of acid phosphatase （ ACP） and N-acetyl-β-D-glucosaminidase （ NAG） were detected by ELISA． And the expression levels of p21，p53 and mTor in the mouse stomach were detected by Western Blotting． Ｒesults In the comparison of the ome group with the control group and the MNNG group with the ome + group，mice spleen weight indexes in the ome group and the ome + group decreased significantly． Meanwhile，mice serum and spleen lysosomal enzyme levels also decreased significantly． Compared with MNNG group，the incidence of gastric cancer in the ome + group was increased significantly． especially in the MNNG + ome high-dose group，． and the difference was statistically significant （ P ＜ 0． 05） ． Compared with the control group，the expressions of p53 in the experimental group was increased，the expressions of p21 decreased，and the expressions of mTOＲ also decreased （ P ＜ 0． 05 ） ． Conclusions Ome can promote gastric carcinogenesis in mice，and its mechanism may be through the inhibition of lysosomal hydrolase enzyme and its fuction in mice，thereby reducing the immune fuction in these mice． Key words： Stomach neoplasms； Omeprazole； Lysosomes； Acid phosphatase； Blotting，western； Mice，knockout
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安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2016 Jun，20（ 6）
奥美拉唑促小鼠胃癌发生的机制研究
何 伟1 ，齐东江1 ，徐阿曼1，2 ，袁 笑1 ，陆 震1 （ 1． 安徽医科大学第四附属医院普外科，安徽 合肥 230032； 2． 安徽医科大学第一附属医院胃肠外科一病区，安徽 合肥 230022）
清洁级 KM 小鼠，雄性，体质量 24 ～ 26 g，共 42 只，由安徽医科大学实验动物中心提供。奥美拉唑 肠溶 片 购 自 山 东 新 时 代 药 业 有 限 公 司，批 号： 009131003。MNNG 购自日本 TCI 公司，于 4 ℃ 冰箱 保存。N-乙酰-β-D-氨基 葡 萄 糖 苷 酶 （ NAG） ELISA 检测试剂盒、酸性磷酸酶（ ACP） ELISA 检测试剂盒 购自百奥莱博； 日立 7020 全自动生化分析仪； SpectraMax 190 酶标仪； JEDＲ801D 形态学图像分析系统 Version6． 0； NOVA 型切片机； 美国 Bio-Ｒad 电泳仪。 2 方法 2． 1 胃癌动物模型建立与分组 小鼠饲养于安徽 医科大学药理教研室动物中心，聚丙烯笼内标准条 件下饲养，温度维持在 24 ℃ ，自动进食饮水。所有 动物随机分为对 照 组、ome 低 剂 量 组、ome 高 剂 量 组、MNNG 组、MNNG + ome 低剂量组（ ome 低 + ） 、 MNNG + ome 高剂量组（ ome 高 + ） 六组，每组 7 只。 后三组饮用水中加入 MNNG 100 mg·L － 1 ，小鼠自 由饮用。ome、ome 低 + 组及 ome 高 + 组小鼠每天 给予 ome 灌胃，低剂量为（ 6 mg·kg － 1 ，按体质量 60 kg 成人每日服用 40 mg ome 为标准，按照小鼠与人 体药 物 剂 量 换 算 公 式 计 算 ） 、高 剂 量 为 30 mg · kg － 1 。动物常规饲养，每周称量体质量一次，24 周 后处死小鼠，收取标本，处死前小鼠禁食 24 h。 2． 2 小鼠脾质量指数测定 小鼠处死前称量小鼠
体质量。脱颈椎处死后剖腹迅速取出小鼠脾脏，分 析天平称重。计算脾质量指数，即脾质量指数 = 脾 脏质量（ mg） / 体质量（ g） 。 2． 3 小鼠胃组织病理形态学观察 用 2． 5% 戊巴 比妥钠 （ 2 mL · kg － 1 ） 腹腔注射麻醉动物后取血。 脱颈椎处死小鼠后迅速打开小鼠腹腔，取出胃 组 织，沿胃大弯侧切开，0． 9% NaCl 清洗三次并把标本 固定，肉眼观察胃黏膜大体形态变化。每只小鼠于 胃底、胃体及胃窦各取两块组织固定于 10% 中性甲 醛溶液，固定 24 h 后，组织脱水、浸蜡、包埋、切片， 行行苏木精-伊红（ HE） 染色，光电下观察胃组织病 理形态学改变。胃黏膜病理变化由病理科医师双 盲读片。 2． 4 小鼠血清及组织中 ACP 及 NAG 含量测定 采用 ELISA 法测定血清及组织中 ACP 和 NAG 含 量。实验步骤严格按照操作说明书操作。并在 450 nm 处测定吸光度值。 2． 5 蛋白质印迹法（ Western Blotting） 随机选取 每组小鼠 5 只，将蛋白从小鼠前胃组织中提取，BCA 法定量蛋白 （ BCA 蛋白检测试剂盒购自中国碧云 天） ，SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白，电泳后将蛋白 转移至聚偏氟乙烯（ PVDF） 膜上，使用含 5% 脱脂奶 的 0． 3% 吐温 20Tris 缓冲盐溶液（ TBST） 封闭 1 h， 分别用兔抗小鼠 p21 抗体（ 购自英国 Abcam 公司） 、 兔抗小鼠 p53 抗体、兔抗小鼠 mTOＲ 抗体（ 购自美 国 Affinity Biosciences 公司） 孵育过夜，TBST 洗三次 后使用羊 抗 兔 IgG 抗 体 （ 购 自 美 国 Affinity Biosciences 公 司 ） 孵 育 2 h，增 强 化 学 发 光 （ Enhanced Chemiluminescence，ECL） 法观察蛋白表达水平，使 用 ImageJ 软件分析结果，计算相对灰度值。 2． 6 统计学方法 所有计量资料以 x ± s 表示，多 组间定量数据的比较采用单因素方差分析（ one-way ANOVA） ，多组之间两两比较采用 SNK-Q 检验的方 法，多组定性数据得比较采用确切概率法，以 P ＜ 0． 05为差异有统计学意义。 3 结果 3． 1 小鼠一般情况 MNNG 组与 ome 低 + 和 ome 高 + 比较小鼠明显不活泼，毛发光泽度较差，食量 减少，但小鼠平均体质量较后两组高，这可能和 ome 可以改善 MNNG 对小鼠的消化道 症 状 相 关。ome 组和对照组比较差异无统计学意义。 3． 2 ome 对小鼠脾质量指数的影响 各组小鼠脾 质量指数见表 1。长期使用 ome 均可导致小鼠脾 质量指数下降。 与 对 照 组 相 比，ome 低 剂 量 组 小 鼠脾质 量 指 数 下 降，但 差 异 无 统 计 学 意 义，ome