毕赤酵母表达知识

很好，需要好好研究一下

原文地址：毕赤酵母表达知识01转载于丁香作者：思时尔非

a.配制500×BIOTIN stock solution（0.02％）有这么3种方案：

1、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；

2、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；

3、水浴加热，温度不能高于50度。

D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。

在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。

b.有几个比较迷惑的问题请教大家：(很典型的小问题）

1、制感受态细胞，OD多少比较好？

pyrimidine 战友的方法：取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP 管中。

说明书还有一些文献是说在1.3左右效率高，再高了效率会很低

2、关于高效转化法，文献说用(LiAc)，而invitrogen的说明书说转化毕赤酵母用(LiAc)没用，要用LiCl。

Lithium acetate does not work with Pichia pastoris. Use only lithium chloride.

3、YNB到底能高温灭么？有的说能有的说不能。

过滤灭菌的怎么操作？

我是把滤器装好膜绑到瓶口用纱布盖上，报纸包上，瓶盖放烧杯里单灭。然后把配好的溶液用注射器一点点推进去。

4、葡萄糖为什么在YPD里一起灭颜色很深，单灭则不会。

该115度还是121度灭？网上搜了下，都有人用！

5、电转化参数用400欧还是200欧？有的用400，有的还专门说不是用400。都是从园里看到的！

电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆（不是400）

6、电转后，在MD平板上长的应该就是整合了目的基因的重组子了吧？

如果不想筛高拷贝的，是否PCR验证一下即可？

网友的回答：

ynb最好不灭菌，我是0.22um过滤处理的。invitrogen手册上可以灭菌的。glucose和含氮化合物在一起容易产生美拉德反应，这是配制培养基中的禁忌。颜色很深的话，基本不能使用了。

想请教下关于菌种保存的方法。

我现在是采用斜面保存的方法，但感觉每次接菌都要打开斜面，而且每次的接菌量难免会有不少的误差，所以很想问一下大家都是怎么保存菌种的，特别是甘油菌的保存方法。

我一般吸取300ul的菌液到灭菌的ＥＰ管然后加等体积的甘油，混匀．防于－２

０度．保存长的话最好放－８０度冰箱一般OD是2-6，过夜菌

在筛选高表达菌种中，我一般有一下步骤，很很多人做的不太一样，和说明书也有点差异，如下：

每次转化前，均用多种酶切，BlgII/salI/sacI同时切，然后转化时，用

GS115/KM71/KM71H同时转化，转化的条件也和大家一样，即1.5/25/200但是我用的是0.1的杯子，不是0.2的，转化后涂MM及YPD+0.25G，长出菌落后，即

进行大规模的表达试验，这里我要重点说明的是，我直接用YPD表达的，一般

48h后即进行大量的SDS-PAGE鉴定，鉴定时，样品不用浓缩，直接上样，看到

目的带后再做PCR，测序。

我已用这儿方法做了好几个基因出来。

关于酵母表达时BMMY的PH值

我也觉得PH7.0-7.5要比PH6.0好，我表达的两个蛋白都是这样，表达量要高一些。但也不能一概而论，不同目标蛋白表达最适pH不一样，不过表达的pH值最好要远离目标蛋白的pI。

像目前国内外做的最好的rHSA，最适pH大概5-6左右，也有不同的报道，可能和工艺页有关系。而我自己正在做的一个蛋白pH4较好，3、5表达时上清电泳

目标带大量减少，杂带大量增多。

求助一下很棘手的问题，大家在酵母表达过程中控制目标蛋白降解方面有什么高招，小弟最近为这个有点儿焦头烂额。

我试过用酸消解酪蛋白，可是作用并不是很明显。

不知道兄台是胞内表达还是胞外表达，如果是分泌表达，目标蛋白确实容易被降解。你可以尝试以下几种办法：1、尽可能降低培养液的pH值减少酶活，酵母生长pH值比较广，4～7都可以试一下；2、多试几种蛋白添加剂，充当酶解底物；

3、摸索最适下罐（摇瓶也一样），宁可少表达点也别给降解光了。实在没办法，只好换菌株或做pcr突变酶切位点（当然不能影响表达和蛋白活性）。

Several strategies have been reported as effective in minimizing the proteolytic instability of specific foreign proteins secreted into the P.pastoris culture medium.

The first is adding to the culture medium of amino-acid rich supplement such as peptone or casamino acid, which reduce product degradation possibly by acting as execess substrates for one or more problem proteases. The second strategy to minimize proteolytic degradation is to optimize the culture pH between pH 3.0 and pH7.0.

The third strategy involves elevating the level ofammonium in the culture broth adequately, which is explained by the hypothesis that portease activity is induced under nitrogen starvation.

The forth strategy is let the culture temperature 28 deg instead of 30 deg.

如何优化密码子来提高蛋白表达量，具体考虑哪些因素（肯定不是单纯的全部置