四 固定化酶的性质

固定化后酶稳定性提高的可能原因


固定化后酶分子与载体多点连接．可防止 酶分子伸展变形。 酶活力的缓慢释放。 抑制酶的自降解。将酶与固态载体结合， 由于酶失去了分子间相互作用的机会，从 而抑制了降解。
(三)固定化酶的最适温度变化



酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度的综 合结果。 由于固定化后，酶的热稳定性提高，所以最适温 度也随之提高，这是非常有利的结果。例如，汤 亚杰等以交联法用壳聚糖固定胰蛋白酶最适温度 为80℃，比固定化前提高了30℃。 也有的固定化后会降低 固定化的最适温度受固定化方法和固定化载体的 影响。
二、固定化细胞的制备



固定化酶的方法大部分适合于微生物细胞 的固定化。 可采用微生物自身的絮凝能力来制备无载 体固定化细胞。 要求保持高的活力保留和具有操作稳定性。
几种方法的特点




化学法(共价交联)涉及菌或细胞的化学修饰。由于所用化学 药品的毒性，可引起细胞破坏。因此，反应耍在尽可能温和 的条件下进行。在使用中细胞间、细胞和载体间的键不易被 底物或盐所破坏，操作稳定性高。 吸附螯合法条件温和、方法简便，但载体和细胞间吸附力弱， 操作时细胞易从载体脱落，特别是底物分子量高，介质的离 子强度和pH变化情况下更是如此，所以操作稳定性差，但优 点是可再生。 包埋法从理论上来说细胞和载体间没有束缚，固定化后应保 持高活力，然而实际上限制酶活力的因素较多，且这类方法 只适于小分子底物。要固定活细胞、增殖细胞，显然包埋法 占优势，尤其采用卡拉胶、海藻酸钙等材料更好。 交联法没有良好机械强度．所以不适于实际应用。但可得到 高细胞浓度，大多数情况难于再生。
(四)固定化酶的最适pH变化
1、固定化后最 适pH升高了 2、pH稳定性增强
最适pH偏移的原因

载体带电荷影响酶所在微环境
一般说来，用带负电荷载体(阴离子聚合物)制备的 固定化酶，其最适PH较游离酶偏高，这是因为多 聚阴离子载体会吸引溶液中阳离子，包括H+，使 其附着于载体表面，结果使固定化酶扩散层H+浓 度比周围的外部溶液高，即偏酸，这样外部溶液中 的PH必须向碱性偏移，才能抵消微环境作用，使 其表现出酶的最大活力。反之，使用带正电荷的载 体其最适PH向酸性偏移。
30
12 8
固定化酶数
提高
不变
降低
稳定性提高方面:



热稳定性提高 保存稳定性好,可在一定条件下保存较长时 间 对蛋白酶的抵抗性提高,不易被蛋白酶水解 对变性剂的耐受性提高,可耐受尿素、有机 溶剂和盐酸胍等蛋白质性剂的作用。 对不同PH(酸度)稳定性提高
A 热稳定性
B有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高
2 偶联率及相对活力的测定


用于表征影响酶固有性质诸因素的综合效 应及固定化期间引起的酶失活. 固定化酶的活力回收是指固定化后固定化 酶(或细胞)所显示的活力占被固定的等当 量游离酶(细胞)总活力的百分数。



活力回收＝固定化酶总活力／加入酶的总 活力x100％ 偶联率＝(加入蛋白活力-上清液蛋白活力) ／加入蛋白活力x100％ 相对活力＝固定化酶总活力／(加入酶的 总活力-上清液中未偶联酶活力)x 100％
五 影响固定化酶性能的因素

固定化酶制备物的性质取决于所用的酶及 载体材料的性质。

Байду номын сангаас

酶本身的变化，主要由于活性中心的氨基 酸残基、高级结构和电荷状态等发生变化; 载体的影响主要是由于在固定化酶的周围， 形成了能对底物产生立体影响的扩散层以 及静电的相互作用等引起的变化。 酶固定化后发生的性质变化是由于上述几 种影响因素综合作用的结果。载体与酶的 直接作用可能表现为活力丧失、破坏酶结 构、封闭酶活性部位等。
4.5固定化酶和固定化细胞的表征
一、评价固定化酶(细胞)的指标 1. 固定化酶(细胞)的活力 2. 偶联率及相对活力的测定 3. 固定化酶(细胞)的半衰期
1固定化酶(细胞)的活力

固定化酶(细胞)的活力即是固定化酶(细胞)催化 某一特定化学反应的能力，其大小可用在一定条 件下它所催化的某一反应的反应初速度来表示。 固定化酶(细胞)的单位可定义为每毫克干重固定 化酶(细胞)每分钟转化底物(或生产产物)的量， 表示为μmol· -1mg-1。如是酶膜、酶管、酶 min 板．则以单位面积的反应初速度来表示．即 μmol· -1cm2。表示固定化酶的活力一般要注 min 明下列测定条件：温度、搅拌速度、固定化酶的 于燥条件、固定化的原酶含量或蛋白质含量及用 于固定化酶的原酶的比活力。

提高固定化酶对各种有机溶剂的稳定性， 使本来不能在有机溶剂中进行的酶反应成 为可能。固定化酶在有机合成中应用会进 一步发展。
C pH稳定性

青霉素酰化酶在不同pH的缓冲液中．于 37℃保温16h测定酶活力。固定化酶在 PH 5.5-10.3活力稳定；游离酶则仅在 pH7.0-9.0稳定。固定化酶的PH稳定性 明显优于游离酶。
四 固定化酶的性质
由于固定化常常是一种化学修饰，酶本身 的结构必然受到扰动，同时酶固定化 后．其催化作用由均相移到异相，由此带 来的扩散限制效应、空间障碍、载体性质 造成的分配效应等因素必然对酶的性质产 生影响。
(一)固定化后酶活力的变化

多数情况下比天然酶小，其专一性也能发 生改变。 例如，用羧甲基纤维素作载体固定的胰蛋 白酶，对高分子底物酪蛋白只显示原酶活 力的30％，而对低分子底物苯酞精氨酸－ 对硝基酰替苯胺的活力保持80%。所以， 一般认为高分子底物受到空间位阻的影响 比低分子底物大。

产物对最适pH的影响 主要是由于固定化载体成为了扩散障碍， 使反应产物向外扩散受到一定限制。
催化反应产物为酸性（H+）， 则最适pH比游离酶高（需 OH-中和）反之则偏低，中性 则不变。
+ + +
+
（五）底物特异性

由于存在空间位阻，可能不再作用于分子 量较大的底物，只对小分子量底物有效。 例：胰蛋白酶可作用于高分子的蛋白质， 又可作用于低分子的二肽或多肽，固定在 羧甲基纤维素上后，对二肽或多肽作用保 持不变，但对酪蛋白的作用仅为游离酶的 3%左右。
测定方法
活力可在两种基本系统——填充床或均匀 悬浮在保温介质中进行测定。 ①间歇测定 在搅拌或振荡反应器中，在与溶液酶同样 测定条件下(如均匀悬浮于保温的介质中) 进行，然后间隔一定时间取样，过滤后按 常规进行测定。 如搅拌速度过快．会由于固定化酶破碎而造 成活力上升。

②连续测定 固定化酶装入具有恒温水夹套的柱中，以 不同流速流过底物，测定酶柱流出液。根 据流速和反应速度之间关系，算出酶活力 (酶的形状可能影响反应速度)。在实际应 用中，固定化菌不一定在底物饱和条件下 反应，故测定条件要尽可能与实际工艺相 同，这样才能利于比较和评价整个工艺。
合成方法

合成方法是利用天然高分子材料包埋 磁性微粒,或在磁流体存在下进行聚合 反应, 均可得到纳米级的磁性微球
2 其它新型载体



导电聚合物作为酶固定化载体时可用于酶 电极类生物传感器的制备。 光敏性单体聚合物包埋固定化酶或带光敏 性基团的载体共价固定化酶时, 条件温和, 可获得酶活力较高的固定化酶。 N - 异丙基丙烯酰胺及其衍生物共聚可得 到温敏性水凝胶载体, 用于固定嗜热菌蛋 白酶时可实现均相催化和异相分离的统一
固定化细胞的缺点



利用的仅是胞内酶，而细胞内多种酶的存 在，会形成不需要的副产物； 细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制 作用; 载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通 透性
一、固定化细胞分类
分类方式 细胞类型 固定化细胞 微生物细胞 植物细胞 动物细胞 生理状态 死细胞 活细胞 完整细胞、细胞碎片、 细胞器 增殖细胞、静止细胞、 饥饿细胞
固定化增殖细胞优点
①
②
③
固定化细胞的密度大、可增殖，因而可获得高 度密集而体积缩小的工程菌集合体，不需要微 生物菌体的多次培养、扩大，从而缩短了发酵 生产周期，可提高生产能力； 发酵稳定性好，可以较长时间反复使用或连续 使用，有希望将发酵罐改变为反应柱进行连续 生产； 发酵液中含菌体较少，有利于产品分离纯化， 提高产品质量等。
(六)固定化酶的米氏常数(Km)变化

固定化酶的表观米氏常数Km，随载体的带电性能变化。 当酶结合于电中性载体时，由于扩散限制造成表观Km上 升，可是带电载体和底物之间的静电作用会引起底物分子 在扩散层和整个溶液之间不均一分布。由于静电作用，与 载体电荷性质相反的底物在固定化酶微环境中的浓度比整 体溶液的高。与溶液酶相比，固定化酶即使在溶液的底物 浓度较低时，也可达到最大反应速度，即固定化酶的表观 Km值低于溶液的Km值；而载体与底物电荷相同．就会造 成固定化酶的表观Km值显著增加。简单说，由于高级结 构变化及载体影响引起酶与底物亲和力变化，从而使Km 变化。这种Km变化又受溶液中离子强度影响：离子强度 升高，载体周围的静电梯度逐渐减小，Km变化也逐渐缩 小以至消失。例如在低离子浓度条件下，多聚阴离子衍生 物-胰蛋白酶复合物对苯甲酰氨酸乙酯的Km比原酶小 96．8％。但在高离子浓度下，接近原酶的Km。
六酶固定化载体材料研究新进展

1磁性高分子微球 磁性高分子微球是指内部含有磁性金 属或金属氧化物(如铁、钴、镍及其氧 化物) 的超细粉末, 而具有磁响应性的 高分子微球.
作为载体的优点
(1) 固定化酶从反应体系中分离和回收简便。对于 双酶体系, 当一种酶失活时, 可以用磁性材料再 固载另一种酶, 回收后反复使用。 (2) 磁性载体固定化酶放入磁场稳定的流动床反应 器中, 可以减少反应体系中的操作,适合大规模连 续化生产。 (3) 利用外部磁场可以控制磁性材料固定酶的运动 方式和方向, 替代传统的机械搅拌, 提高固定化 酶的催化效率。
三、固定化细胞的重要发展方向-基因工 程菌的固定


将基因工程和酶工程相结合，有可能使大 规模培养过程中重组菌的稳定性问题得到 较好解决。 固定化工程菌和游离工程菌相比较，固定 化细胞具有高细胞浓度、克隆产物高效表 达、稳定性好等特性。
4.4 固定化原生质体
固定化细胞缺点: 只能用于生产胞外产物 由于载体的影响产物和底物的扩散受到影响. 溶解氧的传递和输送受到影响. 去除细胞壁障碍就可得到许多胞内产物,减少障 碍. 原生质体:去除细胞壁后的植物或其它生物细胞. 原生质体缺点就是更脆弱,但用载体固定化后就 具有高的稳定性,又比正常细胞少了胞壁障碍.
固定化死细胞

固定化死细胞一般在固定化之前或之后细 胞经过物理或化学方法的处理，如加热、 匀浆、干燥、冷冻、酸及表面活性剂等处 理，目的在于增加细胞膜的渗透性或抑制 副反应，所以比较适于单酶催化的反应。
固定化活细胞


固定化静止细胞和饥俄细胞在固定化之后 细胞是活的，但是由于采用控制措施，细 胞并不生长繁殖，而是处于休眠状态或饥 饿状态。 固定化生长细胞又称固定化增殖细胞．是 将活细胞固定在载体上并使其在连续反应 过程中保持旺盛的生长、繁殖能力的一种 固定化方法。更适合于进行多酶顺序连续 反应。
4.3 固定化细胞

固定化细胞就是被限制自由移动的细胞， 即细胞受到物理化学等因素约束或限制在 一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活 性并具有能被反复或连续使用的活力。这 是在酶固定化基础上发展起来的一项技术。
固定化细胞比固定化酶优越点



固定化细胞保持胞内酶系的原始状态与天 然环境，因而更稳定。 固定化细胞保持了胞内原有的多酶系统， 这对于多步催化转换，如合成干扰素等， 其优势更加明显，而且无需辅酶再生。 还可固定化增殖细胞.
酶活低的可能原因



酶分子在固定化过程中，空间构象会有所 变化，甚至影响了活性中心的氨基酸 固定化后，酶分子空间自由度受到限制 (空间位阻)，会直接影响到活性中心对底 物的定位作用 内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近 受阻 包埋时酶被高分子物质半透膜包围，大分 子底物不能透过膜与酶接近。
酶活反而高的原因

原因可能是偶联过程中酶得到化学修 饰．或固定化过程提高了酶的稳定性。
(二)固定化对酶稳定性的影响

稳定性是关系到固定 化酶能否实际应用的 大问题．在大多数情 30 况下酶经过固定化后 25 20 其稳定性都有所增加， 15 这是十分有利的。 Merlose曾选择50种 10 固定化酶，就其稳定 5 性与固定化前的酶 进 0 行比较。