免疫磁珠技术
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吸取50μL免疫磁珠悬液.加到显色培养基及任一 选择性培养基OXA、PALCAM琼脂平板上.用无菌 接种环划线.35℃士1℃培养22h-48h。 2)筛选 李斯特氏菌在CHROMagar显色培养基上菌落为 蓝色.且在其周围形成一个晕环。李斯特氏菌在OXA 琼脂平板上生长22 h后菌落呈现黑色.直径为1mm. 在其周围形成一个黑色环。培养48h,菌落仍呈黑色 .直径2mm --3mm.除在菌落周围有一环外.在菌落中 心部位的深层也形成黑点。李斯特氏菌在PALCAM 琼脂平板上与在()XA琼脂平板上菌落相似。在 CHROMagar显色培养基及OXA或PALCAM琼脂 平板上挑取5个或更多可疑菌落.接种于TSA-YE琼脂 平板上.纯培养后进鉴定。 5.鉴定和确认
单核细胞增生李斯特氏菌的检测
Skjerve等通过包被单克隆抗体的磁珠从 不同食物样品中分离李斯特菌,采用将磁 珠接种到琼脂平板培养的方法进行菌株鉴 定,此法的敏感性为102~104cfu/mL样品。 Hudson等研究表明,将免疫磁珠技术与PCR 结合,24h内即可检出火腿中的单增李斯特 菌。
2.1.3 沙门氏菌的检测
3.结合:在18℃~30℃环境中,将上述Eppendorff管 连同磁板架放在Dynal MXl样品混合器上转动或用 手轻微转10 min,使E. coli O157与免疫磁珠充分 接触。 4.捕获:将磁板插人到磁板架中浓缩磁珠。在3 min 内不断地倾斜磁板架,确保悬液中与盖子上的免疫 磁珠全部被收集起来,此时,在Eppendorff管壁 中间明显可见圆形或椭圆形棕色聚集物。 5.吸取上清液:取1支无菌加长吸管,从免疫磁珠聚集 物对侧深人液面,轻轻吸走上清液。当吸到液面通 过免疫磁珠聚集物时,应放慢速度,以确保免疫磁 珠不被吸走。如吸取的上清液内含有磁珠,则应将 其放回到Eppendorff管中,并重复4步骤。每个样品 换用1支无菌加长吸管。
免疫配基
免疫配基通过生物高分子的功能基团结合到 磁性载体微球上形成免疫磁珠。由于载体微 球制备材料和方法不同,其表现出的物理性 质也不同, 从而可结合不同的免疫配基, 如抗原、抗体、凝集素、DNA 和RNA 等。 配基必须具有生物专一性的特点, 而且载体 微球与配基结合要不影响或改变配基原有的 生物学特性, 保证磁珠的特殊识别功能。
GB/T 4789.36-2008 免疫磁珠捕获法检测程序
检样 25g(mL)+225mL改良EC肉汤(mEC+n),均质225mL
36± 1oC
↓ 18h~24h ↓
免疫磁珠捕获 涂布CT-SMAC平板和改良CHROMagar O157弧菌显色琼脂平板
36± 1oC
↓
18h~24h
挑取可疑菌落5个~10个,氧化酶阴性,革兰氏阴性杆菌接种TSI
1样品制备 2增菌 3免疫磁珠分离((IMS) 1)免疫捕获 混增菌培养液.沉淀所有的粗糙食物残渣.从增菌培 养液中移取1mL上层液体(要尽可能避免移取到食物 颗粒和脂肪颗粒)加人Eppendorf管中.加20μL准备 好的免疫磁珠。在旋涡混合器上混合该悬液。
2)分离 将Eppendorf管固定在磁架的管孔中。1800轻缓摆 动磁架5次--6次,使免疫磁珠聚集到磁极。小心地打开磁 架上的Eppendorf管管盖,从磁极对面一侧慢慢吸出液 体,注意不要接触管壁上的磁珠。每一个样品换一次枪 头;加1 mI灭菌的PBS ,并重新盖好盖子.将磁极从支 架上移走,1800轻缓摆动磁架5次一6次,使管内各成分 混合,后重新将磁极放回到支架上。重复该清洗步骤几 次。将离心管从磁性分离器上移开.并加100μL灭菌的 PBS到管中,重悬磁珠。如果实验室没有磁性分离器. ,可以用手摇代替. 4.分离培养 1)分离培养
检样25g(mL)
对225mLFB1増菌液(30 ℃士1℃ ,24h士1h)
单 增 李 斯 特 菌 的 检 测 方 法
1mL转种10mL FB2増菌液( 35℃ ,24h士1h)
通过免疫磁珠捕获李斯特菌,然后再用灭菌缓冲液洗涤
用0.1mL的灭菌缓冲液重新制成悬液
吸取50uL免疫磁珠悬液划线于CHROMagar 显色培养基, OXA/PALCAM琼脂平板(35 ℃ +1 ℃,24h~28h) 各挑选5个典型菌落 接种于TSA-YE琼脂平板,纯培养 鉴定和确认试验
6.洗涤:洗涤免疫磁珠混合物。重复上述步骤 4~ 6 。 7.重复上述步骤4 ~ 5 。 8.免疫磁珠悬浮:将免疫磁珠重新悬浮在100 μL PBS-Tween 20洗液中。 9.涂布平板:用漩涡混合器将免疫磁珠混匀,用加样 器各取50 μL免疫磁珠悬液分别转移至CT-SMAC平 板和改良CHROMagar O157弧菌显色琼脂平板一 侧,然后用无菌涂布棒将免疫磁珠涂布平板的一半 ,再用接种环划线接种平板的另一半。待琼脂表面 水分完全吸收后,翻转平板,于36℃士1 0℃培养18 h---24 h 。
IMB技术的优点
IMB技术适用于各类食品基质中的沙门氏菌的快 速检测,能快速有效富集食品基质中的目标病原 菌,且有良好的灵敏度和特异性,检测限可达到 1—10cfu/25g;在检测时间方面可将常规检测方 法中的72小时检测周期缩短至40小时,而且能 有效减轻过程交叉污染;筛选结果既可以与常规 的细菌生化和血清学联用,也可以和显色培养基、 荧光PCR以及微生物全自动鉴定仪器等方法联 用,为食源性致病菌的检测和鉴定提供了有效的 快速筛选技术。
2.1.2 单核细胞增生李斯特菌的检测
传统的单增李斯特菌检测方法检测周期长, 约5~14d,步骤繁琐且灵敏度低,而IMB技术 的优点在于在较低的菌液浓度时也可以通过 免疫磁珠的富集作用进行检测,缩短了检测 时间并进一步降低了单增李斯特菌的检测限。 2008年,我国将免疫磁珠检测单核细胞 增生李斯特菌的方法纳入了出入境检验检疫 行业标准中(SN/T 0184.3-2008)。
菌落识别 在CT-SMAC平板上,典型菌落为不发酵山梨醇的圆形、光 滑、较小的无色菌落,中心呈现较暗的灰褐色;发酵山梨醇的菌 落为红色;在改CHROMagar O157弧菌显色琼脂平板上为圆 形、较小的菌落,中心呈淡紫色一紫红色,边缘无色或浅灰色 。 初步生化试验: 在CT-SMAC和改良CHROMagar O157弧菌显色琼脂平 板上挑取5个~10个典型或可疑菌落,分别接种TSI琼脂,同时 接种MUG-LST肉汤,于36℃士1℃培养18 h~24 h。必要时 进行氧化酶试验和革兰氏染色。在TSI琼脂中,典型菌株为斜 面与底层均呈阳性反应呈黄色,产气或不产气,不产生硫化氢 (H2S)。置MUG-LST肉汤管于长波紫外灯下观察,无荧光产 生者为阳性结果,有荧光产生者为阴性结果;对分解乳糖且无荧 光的菌株,在营养琼脂平板上分纯,于36℃士1℃培养 18 h~24 h,并进行鉴定。
1.免疫磁珠技术简介
1.1
免疫磁珠的结构与性质
1.1.1 免疫磁珠的结构 免疫磁珠(IMB), 也称免疫磁性微球, 是一 种均匀、具有超顺磁性及保护性壳的球形小粒子, 基本上由载体微球和免疫配基结合而成。其核心为 顺磁性粒子,核心外层包裹一层高分子料, 最外层 是免疫配基。
载体微球
磁性物质
大肠杆菌O157的检测
Fratamico等将兔抗E.coli O157∶H7多克隆抗体 连接到羊抗兔IgG包被的磁珠上,从食物增菌培 养液中分离O157∶H7菌株,再将带菌的磁珠接种 到培养基上,加入荧光素标记的O157∶H7抗血清, 在荧光显微镜下观察,此法敏感性为10cfu/mL增 菌培养液。 Decory等建立了免疫磁珠-免疫脂质体(IMB/IL) 荧光试验方法,可在8h内快速检测出多种液态样 品(水样、苹果汁、苹果酒)中低至1cfu/mL的E. coli O157∶H7,而传统微生物学方法不能从阴性 样本中区分出E. coli O157∶H7感染样本。
例1:Notzon等用IMB-荧光PCR检测肉类中的 沙门氏菌,实验包括非选择性增菌、免疫磁珠 分离、DNA提取及PCR扩增,12~13h即可完 成检测过程,IMB-荧光PCR在检测自然感染肉 类和人工感染肉类都具有较高的敏感性和特异 性。
例2:Blackburn 等将用生物素标记的抗沙门 菌多价多克隆抗体连接到链霉亲和素包被的磁 珠上,以此试剂检测从不同食物中提取的活沙 门菌。此法的敏感性可达105cfu/g 食物,总的 检测时间从5d减少至1~2d。
金属小颗粒(Fe2O3、Fe3O4)
载体微球
高分子层
如聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚醋酸乙 烯脂、聚丙烯酸、酶类、多糖(淀粉、 纤维素、葡聚糖、果胶等)、球蛋白 和牛血清白蛋白等,
功能基
如氨基(-NH2)、羧基(-COOH)、 羟基(-OH),使其表现具有疏水亲水、非极性-极性、带正电荷-带 负电荷等不同的物理性质。
免疫磁珠技术(IMB)在食品 有害微生物检测中的应用
资料搜集:武菁菁、张端莉、谭玉荣、周梦柔 PPT制作:孙文静、魏炜 报告人 :孙文静
目录
1
免疫磁珠技术简介
1.1
免疫磁珠的结构与性质 1.2 免疫磁珠技术
2
2.1
免疫磁珠技术的应用
IMB技术在食品有害微生物检测中的应用 2.2 免疫磁珠与其它检测手段的联用 2.3 免疫磁珠技术在其他领域的应用 2.4 免疫磁珠技术的优缺点及发展方向
1.1.2
免疫磁珠的性质
由于免疫磁珠的大小和形状具有均一性, 从而可使 靶物质迅速和有效地结合到磁珠上,也可使生成的 新复合物在磁场中具有相同的磁响应性,且行为一 致 磁珠的球形结构可消除与不规则形状粒子有关的非 特异性结合 顺磁性可使磁珠置于磁场时显示其磁性,并做定向 移动, 从磁场移出时磁性消除, 磁珠分散, 由此可 方便地进行分离和磁性导向 保护性壳可防止磁性内核漏出或被载液腐蚀; 免疫配基可特异性地结合反应体系中相应的抗原、 抗体、核酸等生物活性物质。
1.2 免疫磁珠技术
源自文库
免疫磁珠( immunomagnetic bead, IMB)技术: 是一种以特异的抗原抗体反应为基础的免疫学检测和 分离技术。它是以抗体包被的磁珠为载体,通过抗体 与反应介质中特异性抗原结合,形成抗原—抗体复合 物,此复合物在外加磁场的作用下发生定向移动,从 而达到分离抗原的目的。 基本原理:磁性微球经过一定处理后,可将抗体结合 到磁珠上,形成免疫磁性微球,免疫磁性微球的抗体与 特异性抗原结合形成抗原—微球复合物,该复合物在 磁场中具有与其它组分不同的磁响应性,在磁力作用 下,该复合物发生力学移动,从而达到分离抗原的目的。
2.1.1 大肠杆菌O157的检测
传统分离E.coli O157∶H7所采用的直接分离 法存在着鉴别力差、抑制杂菌能力弱、耗时长、 工作量大等缺点。 采用免疫磁珠技术,能够快速地从各种食品样 品中分离富集E.coli O157∶H7,满足流行病学 的研究要求和提高控制力度。 现在这种免疫磁珠的方法已经被英国公共健 康服务实验室认定为标准的分离方法,我国也 已将免疫磁珠法对大肠杆菌O157的检测纳入 国家标准(GB/T 4789.36-2008)和出入境检 验检疫行业标准(SN/T 1059.5-2006)。
↓
↓
MUG-LST
36± 1oC 18h~24h
阳性
非O157细菌
阴性
↓ ↓
血清学试验 生化试验
↓
报告
具体操作步骤
增菌
免疫磁珠捕获与分离 1.将Eppendorff管按样品和质控菌株进行编号,每 个样品使用1支Eppendorff管,然后插人到磁板架 上。在漩涡混合器上轻轻振荡E. coli O157免疫磁 珠溶液后,用开盖器打开每支Eppendorff管的盖 子,每管加人20 μL E. coli 0157免疫磁珠悬液。 2.取mEC+n肉汤增菌培养物1 mL,加人到 Eppendorff管中,盖上盖子,然后轻微振荡10 s。 每个样品更换1支加样吸头,质控菌株必须与样品分 开进行,避免交叉污染。
2 .免疫磁珠技术的应用
2.1 食品有害微生物检测中的应用
免疫磁珠技术与常规检验方法相比具有显著的 优点,它能从样品中迅速、有选择性地分离出 目的微生物,有效地减少了背景的干扰,提高 了精准性。 还能捕获受损伤的靶细菌,而目前所用的几种 常规方法则不具备这样的能力。目前,免疫磁 珠技术已经广泛应用于食品样品中致病微生物 的检测。