SNP分子标记的原理及应用解析

药物基因组学研究
SNPs 可以精细地反映个体的遗传差异,SNPs 位点与个 体的药物反应进行相关分析,从而确定基因在药物作用 中的功能和意义。这样既可以根据患者的遗传特性设 计治疗方案,实现“个性化治疗”,提高药效，降低药物 的毒副作用,又可以在临床试验阶段为特定的药物选择 合适的受试者,提高效率,减少费用。
SNP 的应用
种族遗传学 T a n g 等研究了来自世界五个地区(中国、马来、高加 索、印度和非洲) 人群的MDR1 基因的单倍体和连锁不
平衡特征,发现具有e12/ 1236T2e21/ 2677T2e26/ 3435T
亚型的单倍型m h 5 在非洲人群以外的四种人群中高度
表达,而具有e12/ 1236C2e21/ 2677G2e26/ 3435C 亚型的
Seal plate
Analyze
加样 封口 震荡 30 分钟 离心 分析
BigDye® XTerminator™ Purification Kit
6.DNA测序法
直接测序是最容易实施的SNP检测方法。 原理: 通过对不同个体同一基因或基因片段进行测序和序列比较, 以确定所研究的碱基是否变异, 其检出率可达100%。 特点：可以得到SNP 的类型及其准确位置等SNP分型所需要的重 要参数。
单倍型mh7 在非洲人群中占了1/ 3 以上,进一步证明了 种族间的表形差异。
疾病易感性研究 原理：SNPs 被认为是一种稳定遗传的早期突变,与疾病有 着稳定的相关性。当一个遗传标记的频率在患者明显超过 非患者时 ,即表明该标记与疾病关联 ,通过比较分析两者的 单倍型和研究连锁不平衡性 , 可将基因组中任何未知的致 病基因定位。 Horikawa 等应用 SNPs作为遗传标记通过基于连锁不平衡 的相关分析 , 在墨西哥裔美国人群和北欧人群中发现了一 个 DM 易感基因 , 该基因第三个内含子上的 A/ G 多态性 (SNP43) 同2 型糖尿病(2 型DM) 连锁,该位点为纯合子G的 个体患2 型DM 的风险增加,这是目前为止所发现的第一个 与2 型DM 相关的SNP ,预示了SNP 在DM 相关基因研究中 的重要作用。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
特点：由于该方法简单快速，因而被广泛运用于未知 基因突变的检测。这种方法的弊端在于不能确定突 变类型和具体位置。
1.3 变性梯度凝胶电泳（DGGE）
原理：是利用长度相同的双链 DNA片段解链温度 不同的原理,通过梯度变性胶将 DNA片段分开的电 泳技术。
2. 等位基因特异 PCR ( AS-PCR)
1.2 单链构象多态性(SSCP)
原理：单链DNA 在中性条件下会形成二级结构，不同 的二级结构在电泳中会出现不同的迁移率。这种二 级结构依赖于碱基的组成，单个碱基的改变也会影 响其构象，最终会导致在凝胶上迁移速度的改变。 在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链 DNA 和RNA 分子依其单碱基序列的不同而形成不同的构象，这 样在凝胶上的迁移速率不同，出现不同的条带，检 测SNP。
原理：根据 SNP位点设计特异引物,其中一条链(特异链)的3′末端与 SNP位点 的碱基互补(或相同) ,另一条链(普通链)按常规方法进行设计,因此,AS-PCR 技术是一种基于SNP的PCR标记。因为特异引物在一种基因型中有扩增产 物,在另一种基因型中没有扩增产物,用凝胶电泳就能够很容易地分辨出扩 增产物的有无,从而确定基因型的 SNP。
质粒
PCR产物
纯化
SNaPshot PCR 纯化 电泳样本制备 电泳 软件分析
SNaPshot PCR
用量 (μ L / Sample) Reaction Mix Pooled PCR Products Pooled Primers dH2O 总体积
标准体系 文献A 文献B 文献C 文献D 5 2 2 2 3 3 2 1.5 2 9 1 2 1 8 1 10 6 5 5 20
8.变性高效液相色谱( DHPLC)
原理：目标核酸片段PCR扩增，部分加热变性后， 含有突变碱基的DNA序列由于错配碱基与正常碱基 不能配对而形成异源双链。因包含错配碱基的杂合 异源双链区比完全配对的同源配对区和固定相的亲 和力弱，更易被从分离柱上洗脱下来 , 从而达到分 离的目的。SNPs的有无最终表现为色谱峰的峰形或 数目差异,依据此现象可很容易从色谱图中判断出突 变的碱基。 特点：使用高效液相色谱检测SNPs具有检测效率高， 便于自动化的优点，对未知SNPs的准确率可达95% 以上。但 DHPLC 检测对所用试剂和环境要求较高 , 容易产生误差, 不能检测出纯合突变。

对照: 30个反应


一管做10个位点
6条对照引物: 20A, 28G/A, 36G, 44T, 52C/T, 60C 对照模板DNA: Ampliconfrom CEPH DNA

0.01 ~ 0.4 pmol纯化的PCR模板 Matrix Standard DS-02
[dR110, dR6G, dTAMRA™, dROX™, LIZ™]
通过引物延伸或切割反应与灵敏、可靠的MALDITOF质
谱技术相结合，实现基因分型检测。 基于MassARRAY® 分子量阵列平台的iPLEX GOLD技 术可以设计最高多达40重PCR反应和基因型检测，实验 设计非常灵活，分型结果准确性高。特别适合于对全基
因组研究发现的结果进行验证，或者是有限数量的研究
AB——New Master Mix
定量分析 高灵敏
TaqMan® Gene Expression Master Mix
• 定性分析
– 高特异性
TaqMan® Genotyping Master Mix
4. 等位基因特异性杂交
等位基因特异性杂(Allele specific hybridization ,ASH) 根据核苷酸探针和互补的目的片段进行杂交，完全匹配和 有错配两种情况下杂交复合体稳定性的不同而将 SNP 位点
检测出来。
等位基因特异核苷酸片段分析( ASO) ，基因芯片和动态等 位基因特异性杂交( DASH) 等。
5.引物延伸法--单碱基延伸法
单重SNaPshot数据
多重SNaPshot反应原理
SNaPshot操作流程
SNaPshot™Multiplex试剂盒
SNaPshot™Multiplex Ready Reaction Mix
管经强激光激发，核酸分子解吸附为单电荷离子，电场中
离子飞行时间与离子质量成反比，通过检测核酸分子在真 空管中的飞行时间而获得样品分析物的精确分子量，从而 检测出SNP位点信息。☺
优势
（1）质谱仪检测的是分子最本质的特征之一——分子量，不涉及 荧光标记、凝胶电泳等，就能检测一个碱基的差异，准确性高，机 器本身出错的概率非常低； （2）质谱仪的灵敏度非常高，检测窗口内，任何pmol级别的物质 都能被检测出来； （3）通量高：几秒就能检测完一个反应孔； （4）操作简单，仪器要求简单，除质谱仪外，都是常规PCR仪器； （5）灵活：每天可以完成几个反应至上万个反应； （6）便宜：引物不带荧光标记，普通长度（3条引物总长80bp左 右），此外在一个反应孔内能完成4个或更多的反应，即通常所说 的4重反应； （7）兼容性强：质谱仪还能在核酸的其它方向，以及蛋白质组学、 微生物鉴定等领域也能应用。 （8）质谱技术是“一管式操作”，即反应体系在生化学实验过程 中始终在一个试管内反应，没有多次转移，这样就减少被污染的概 率。
遗传育种的应用 检测水稻SNP，研究优良性状与SNPs的关联关系，指 导育种。
SNP的检测方法
基于以下9 种基本原理: 1. 以结构为基础;
1.1 限制性片段长度多态性法 （RFLP ）; 1.2 单链构象多态性法 （SSCP ）; 1.3 变性梯度凝胶电泳 （DGGE ）;
2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
SNP 的特点
（1）密度高 S N P在人类基因组的平均密度估计为 1\1000 bp , 在整个基因组的分布达 3×106个。 （2）富有代表性 某些位于基因内部的S N P 有可能 直接影响蛋白质结构或表达水平, 因此, 它们可能代 表疾病遗传机理中的某些作用因素。 （3）遗传稳定性 与微卫星等重复序列多态性标记相 比, SNP 具有更高的遗传稳定性。 （4）易实现分析的自动化 SNP标记在人群中只有两 种等位型(allele) 。这样在检测时只需一个“ + \- ”或 “全\无”的方式,这使得基于S N P的检测分析方法易实 现自动化。
等位基因特异PCR（AS-PCR）; RT-PCR; 等位基因特异性杂交; 引物延伸法--单碱基延伸法; DNA直接测序法; 飞行质谱仪 (MALDI- TOFMS )检测; 变性高效液相色谱 ( DH PLC )法；
1.1 RFLP法
原理：利用限制性内切酶的酶切位点的特异性，用两种或 两种以上的限制性内切酶作用于同一 DNA 片断，如果存 在 SNP 位点，酶切片断的长度和数量则会出现差异，根 据电泳的结果就可以判断是否SNP位点。
SNP分子标记的原理 及应用
、
SNP 的概念
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，指 由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性。在 不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大 多数核苷酸序列一致而只有一个碱基不同的现象，即SNP。 它包括单碱基的转换, 颠换、 插入及缺失等形式。
位点已经确定的情况。
MassARRAY技术原理:
先通过P C R扩增目标序列，然后加入S N P序列特异延伸引
物，在 S N P 位点上，延伸 1个碱基，在反应体系中以
ddNTP替代dNTP，使探针仅在SNP位点处延伸一个碱基即 终止。根据SNP位点的不同，探针将结合不同的ddNTP， 从而具有不同的分子量。 将制备的样品分析物与芯片基质共结晶后在质谱仪的真空
7.飞行质谱仪 (MALDI- TOFMS )检测
原理：是将变性的单链PCR产物通过与硅芯片上的化合 物共价结合后 , 在硅芯片上进行引物的退火 , 延伸反应 ,
突变部位配对的碱基与正常配对的碱基不相同。根据引
物在延伸反应中所结合的不同碱基的不同质量在质谱仪 上显示不同峰而检测SNP。
SNP 分型的方法多种多样， MassARRAY 分子量阵列技 术是Sequenom公司推出的世界上领先的基因分析工具，
3. RT-PCR
实时荧光PCR 技术( RT-PCR )一种通过检测 PCR 过程中和 PCR 之后产生的荧光信号来区分等位基因类型的SNP 检测技 术, 同时基于荧光能量转移原理( FRET) 。每检测一个SNP 位 点需要一条探针, 其3‘ 端连有淬灭剂基团, 5’ 端连有荧光剂基 团, 最终与SNP 位点完全匹配时探针结构被破坏, 从而发出荧 光而被检测。
SNaPshot PCR产物纯化
乙醇沉淀法: 11 个步骤, > 1 小时
Add reagents
Seal plate & incubate
Centrifuge
Empty plate
Add reagents
Seal plate & incubate
Centrifuge
Empty plate
Dry
Re-suspend