蛋白酶解及质谱鉴定完整操作流程

蛋白酶解及质谱鉴定完整操作流程
仪器：
ABI 4800 MALDI-TOF/TOF串联质谱仪(ABI)、真空冷冻干燥机、水浴锅、Mascot分析软件、移液器、离心管
主要溶液配置：
考染脱色液：25mmol/L NH
4HCO
3
、50%乙腈的水溶液
银染脱色液：15mM K3Fe(CN)6、50mM NaS2O3的水溶液脱水液1：50%的乙腈溶液
脱水液2：100%的乙腈
吸胀液：25mmol/L NH
4HCO
3
的水溶液
酶解覆盖液：25mM的NH
4HCO
3
、10%乙腈的水溶液
酶解工作液：含0.02ug/ul胰蛋白酶的酶解覆盖液蛋白萃取液：含5% TFA、67%乙腈的水溶液
一、实验操作：
1、将0.2ml的枪头前端剪去2cm左右，以增大孔径，
2、将枪头垂直戳向凝胶上的蛋白点，旋转枪头直至将胶点取下，
3、将取好的胶粒转入装有去离子水的0.5ml离心管里，用枪头反复吸打溶液至枪头内胶粒进入离心管，
4、吸干去离子水后封盖保存并做好标记。

二、注意事项：
1、离心管最好用进口离心管，以免塑料污染；水最好用去离子水，
2、取点时带好口罩与手套以及头套，以免皮屑等角蛋白的污染，
3、蛋白鉴定需要的蛋白量越多越好，所以尽可能把某一个点里所有的蛋白全部取到，不过某些比较大的点就只要取一部分就可以了，
4、针对特别小的蛋白点，枪头孔径可能会比蛋白点面积大，取点时把该蛋白点的边上空白部分也一起取一些下来也不要紧，
5、蛋白点的纯度越高越容易鉴定，一般双向电泳的点都是独立的蛋白，纯度完全满足鉴定的要求，针对有部分交叉的蛋白点，取点时注意不要取混，混合的蛋白点增加质谱鉴定的难度，降低鉴定成功率，
6、取完的蛋白点可以放在室温下保存1周左右，可以放在-20度或者-80度保存半年以上，
7、只有胶图上清晰可见的蛋白点，其含量就足够用于质谱鉴定，所以只要取一次蛋白点就可以了，不需要把几张胶上的蛋白点取了放在一起进行鉴定，同时注意不要把胶点弄得太碎
8、条件允许的话可以多取一次胶点的重复以做好备份。

一、考马斯亮兰染色蛋白点的酶解：参考[Katayama H., Nagasu T., Oda Y., Improvement of in-gel digestion protocol for peptide mass fingerprinting by
matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, Rapid Communications in Mass Spectrometry, 15, 1416 - 1421]的方法进行
1、将切取的蛋白胶点转入0.5ml进口离心管中，采用超纯水漂洗两次，
2、加入考染脱色液，脱色30min，
3、吸出脱色液，加入脱水液1，脱水30min，
4、吸出脱水液1，加入脱水液2，脱水30min，
5、吸出脱水液2，加入10ul酶解工作液，吸胀30min，
6、加入20ul酶解覆盖液，37℃水浴酶解过夜，
7、酶解后上清转移至另一新离心管中，
8、加入50ul蛋白萃取液于剩下的胶中，37℃温浴30min，5000g离心5min，合并上清，冻干后待做质谱。

二、硝酸银染色蛋白质酶解：
1、将切取的蛋白胶点转入0.5ml进口离心管中，采用超纯水漂洗两次，
2、吸出水，加入银染脱色液，脱色10min，
3、吸出脱色液，加入去离子水停止反应，
4、吸出去离子水，再加200ul 去离子水洗胶点一次，
5、吸出去离子水，加入吸胀液5min，
6、吸出吸胀液，加入脱水液1，脱水30min，
7、吸出脱水液1，加入脱水液2，脱水30min，
8、吸出脱水液2，加入10ul酶解工作液，吸胀30min，
9、加入20ul酶解覆盖液，37℃水浴酶解过夜，
10、酶解后上清转移至另一新离心管中，
11、加入50ul蛋白萃取液于剩下的胶中，37℃水浴30min，5000g离心5min，合并上清，冻干后待做质谱。

质谱操作及数据库检索：
1、将干粉重新溶解于5ul含0.1%TFA的溶液中，然后按照1：1的比例与含50%ACN和1%TFA的α-氰基-4-羟基肉桂酸饱和溶液混合，
2、取1ul样品进行质谱点靶鉴定，仪器为API4800串联飞行时间质谱仪 （MALDI-TOF/TOF），
3、采用正离子模式和自动获取数据的模式进行数据采集；PMF的质谱扫描范围为800-3500 Da；选择强度最大的10个峰进行二级质谱，
4、将一级和二级质谱数据整合并使用GPS 3.6（Applied Biosystems）和Mascot2.1(Matrix Science)对质谱数据进行分析和蛋白鉴定，
5、搜索参数如下：数据库为NCBInr；酶为胰蛋白酶；允许最大漏切位点为1；固定修饰为：Carbamidomethyl (C)；可变修饰为：Oxidation (M)； MS tolerance为0.15Da, MS/MS tolerance 为：0.25Da. Protein score C.I.%
大于95为鉴定成功。