结核杆菌对利福平药物敏感性试验论文

结核杆菌对利福平药物的敏感性试验【摘要】目的分析结核分枝杆菌对利福平的耐药现况，为结核病的防治提供依据。方法采用直接涂片检查法和培养法，对肺结核病人的痰液进行检查，阳性标本经抗酸染色镜检确认后，采用绝对浓度法的间接法进行耐药性确定，结果 131例疑似肺结核病人痰标本中，直接涂片法检出阳性标本21例，阳性检出率为16.0%

（21/131）；培养法共检出阳性标本56例，阳性检出率为42.7%（56/131）；比较两种检测方法的阳性检出率，差异有显著性（p＜0.05）。培养法高于直接涂片法，将培养阳性标本进行利福平药物敏感性试验，其中有17株发生耐药，耐药率为30.4%（17/56），结论结核杆菌对利福平的初始耐药率仍处在较高水平，必须进一步加强对耐药结核杆菌的监控。

【关键词】结核分枝杆菌利福平药敏试验

中图分类号：r378 文献标识码：b 文章编号：1005-0515（2011）5-260-02

结核病是我国重点控制的重大疾病之一，也是全球关注的公共卫生问题和社会问题，世界卫生组织已将结核病作为重点控制的传染病之一。全球80%的结核患者分布在22个结核病高负担国家，中国是其中之一，结核患者人数仅次于印度居世界第二位[1]。但是，近10年来，临床上发现抗结核药的耐药性对结核病化疗效果的影响日益严重，尤其是利福平耐药的发生率不断上升给抗结核治疗带来较大的困难。为了解结核杆菌对利福平耐药的状况，为临床合理、

联合用药提供依据，特作本研究。结果报告如下：

1.1病例来源

2007年11月～2008年9月，在青海省海西州人民医院、海西州疾控中心检查首次确认为肺结核的病人，共131例。病例发病前均未服用过抗结核药物。结核分枝杆菌参考菌株为h37rv敏感株，由中国结核病防治临床中心国家参比实验室提供。

1.2痰液直接涂片检查

用接种环取脓性痰液1～2环，均匀涂于载玻片上，待自然干燥，微火焰固定，经抗酸染色后镜检。

1.3分枝杆菌培养

1.3.1培养基

为酸性罗氏培养基。成分：谷氨酸钠（纯度95%以上）

7.2g,kh2po414g,mgso4·7h2o0.24g,枸橼酸镁0.6g，甘油12ml，蒸镏水600ml，马铃薯淀粉30g，新鲜鸡卵液1000ml，2%孔雀绿水溶液20ml。

制备方法

各盐类成分溶解后，加马铃薯淀粉，混匀，沸水浴煮沸1h呈湖状（不时摇动，防凝块），待冷后，加经消毒纱布过滤的新鲜鸡卵液，混匀，再加入2%孔雀绿水溶液，混匀，分装于经121℃高压灭菌的中型度管，每管加培养基约4ml,斜置血清凝固器内1～2层，斜面高度占试管2/3.90℃1.5h或85℃1h间歇2次。冷却后，37℃无菌试验24h。培养基斜面颜色鲜艳，表面光滑无泡，有一定韧性

和酸碱缓冲能力，4℃保存，1个月内使用。

1.3.3接种方法

取痰标本1～2ml，加入1倍量4%naoh，于室温下放置30min（期间振荡2～3次）后，取处理消化后痰液0.1ml，无菌操作接种于培养基斜面上，每份标本同时接种2坛酸性改良罗氏培养基，放置37℃恒温箱培养。每周观察1次，记录细菌生长情况，至8周为止。

1.4过敏试验

具体操作参照结核病诊断细菌学检验规程[2]。

1.4.1药物

利福美国sigma公司生产，北京索莱宝科技有限公司提供。为纯品，粉剂。

1.4.2培养基

改良罗氏培养基。成分：谷氨酸钠（纯度95%以上）

7.2g,kh2po4·2.4g,mgso4·7h2o2.4g,枸橼酸镁0.6g，甘油12ml，蒸镏水600ml，马铃薯淀粉30g，新鲜鸡卵液1000ml,2%孔雀绿水溶液20ml。

1.4.3制备方法

制备方法同酸性罗氏培养基，只是在培养基制成后分装于中型试管前，按每100ml培养基加入1ml利福平稀释药液，混匀，再行分装中型试管，加温凝固成斜面。

1.4.4利福平药液配制及稀释

利福平药物为纯品，生物效价为1000μg/mg，配制2个浓度的

含药培养基，药物浓度为：50μg/ml、250μg/ml。根据痰培养阳性标本例数，每支试管含培养基4ml，计算所需培养基体积。每100ml 培养基加入1ml利福平稀释药液。

1.4.5菌悬液的制备及接种方法

参照《全国临床检验操作规程（第3版）》进行。

1.4.6质控

每批药敏试验应以结核分枝杆菌参考菌株（h37rv）检测含药培养基质量。

1.4.7结果判定

对照培养基菌落数必须在200以上且无融合。若菌浇数低于50时，重新做药物敏感性测定。

（-）：培养基斜面上无分枝杆菌菌落生长。

（1+）：菌落数约占斜面面积的1/4。

（2+）：菌落数约占斜面面积的1/2。

（3+）：菌落数约占斜面面积的3/4。

（4+）：菌落呈菌苔样生长。

菌落数少于20个时，报告菌落数。含药培养基菌落数少于20

个时，当作不生长。低浓度含药培养基上生长的菌落数多于20个时，即可判定为耐药。低浓度生长、高浓度不生长为中度耐药；高、低浓度均生长为高度耐药。

2结果

2.1痰涂片情况131例肺结核病人标本中，共有21例痰涂片为

阳性，阳性率为16.0%。

2.2痰培养情况131例标本中，经培养有菌生长且经抗酸染色镜后，共有56例确定为结核分枝杆菌，阳性检出率为42.7%。两种检测方法其阳性检出率比较，差异有显著性（p＜0.05）。培养法高于直接涂片法。与直接涂片法比较：*p＜0.05（x2检验）

2.4药敏试验结果

质控h37rv生长情况：对照培养基为4+，高、低浓度含药培养基均不生长，为敏感。故所配制的培养基质量合格，能用于药物敏感性测试。

56株痰培养阳性标本中，共有17株出现耐药，总耐药率为30.3%，其中，属中度耐药有10株，耐药率为17.8%，属高度耐药有7株，耐药率为12.5%。

3讨论

直接涂片检查法和分枝杆菌培养法是结核实验室诊断中常用的2种方法，2种方法的阳性检出率对结核病实验室诊断有重要影响。本研究中培养法阳性检出率高于直接涂片检查法。因此，临床上可将2种方法结合使用，以提高结核菌的阳性检出率。

耐药性试验不仅是临床选择和评价化疗方案的依据，更是流行病学的重要指标。利福平自1971年发明以来，一直是结核化疗方案中的一个关键药物，特别在短程化疗中起着重要作用。而对利福平的耐药意味着一方面由于患者对利福平耐药，临床上须加大用药剂量或改用其他抗结核药物，使患者的疗程延长，增加患者的危险