6分子生物学研究方法(下)基因功能研究技术

响，也可用于改造DNA调控元件特征序列，修饰表
达载体，引入新的酶切位点等。
体外寡核苷酸介导的DNA突变技术
重叠延伸介导的定点诱变
6.2 基因敲除技术
6.2.1 基本原理 6.2.2 高等动物基因敲除技术
6.2.1 基本原理
经典遗传学
现代遗传学
基因敲除(gene knock-out)又称基因打靶,通过外源DNA 与染色体DNA之间的同源重组,进行精确的定点修饰和基


RNA原位杂交技术的操作过程
1.
组织细胞的固定
2.
3.
预杂交
杂交
4.
5.
冲洗
显示
荧光原位杂交
FISH技术操作步骤

探针的准备和标记； 探针和染色体的杂交； 信号检测； 杂交信号与分带染色体的比较
6.1.4 基因定点突变技术

通过改变基因特定位点的核苷酸序列来改变所编码 的氨基酸序列，常用来研究某个（些）氨基酸残基 对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影
又称为转录后基因沉默(PTGS)。
6.4 DNA与蛋白质相互作用研究
1. 凝胶阻滞试验（gel retardation assay） 又叫作DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay ），用于体外研究DNA与蛋白质相互作用。 在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移 动的距离与其分子量的对数成反比。如果此时DNA分子与 某种蛋白质相结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中 的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极 移动的距离也就相应缩短了。
2.
3.
连接产物以标签酶酶切后用Klenow酶补平5'突出端，得到 两组分别带有接头A、B的短cDNA片段（约50个碱基）。混 合并连接两组短cDNA片段，形成一个约100个碱基的双标签
体（ditag）群，并以引物A和B对其进PCR扩增。
4.
用锚定酶切割扩增产物，分离纯化去除接头后的双标签体 （约26个碱基），并使之相互连接成为大片段的连接体， 克隆至质粒载体内形成一个SAGE文库以备集中测序。
因改造,具有专一性强,染色体DNA可与目的片段共同稳
定遗传等特点.
1.完全基因敲除
打靶载体： 新霉素（neomycin, Neo）阳 性筛选标志 HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱 疹病毒(herpes simplex virus)胸腺嘧啶激酶 (thymidine kinase)
2.
条件型基因敲除
6 分子生物学研究方法(下)
——基因功能研究技术
6.1 基因表达研究技术
6.1.1 基因表达系列分析技术 6.1.2 RNA的选择性剪接技术
6.1.3 原位杂交技术
6.1.4 基因定点突变技术
6.1.1 基因表达系列分析技术
一．

概念：
以DNA测定为基础定量分析全基因组表达模式的技术
二．

原理：
5.
对测序得到的标签数据进行分析处理。
6.1.2 RNA的选择性剪接技术
概念
是指用不同的剪接方式（选择不同的剪接位点组合）
一．

从一个mRNA前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。
二．
分类
三．
选择性剪接的研究方法（RT-PCR）
6.1.3 原位杂交技术
一．
概念

用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检
测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对
核酸进行定位和相对定量研究的一种手段
二．
分类 RNA原位杂交技术 染色体原位杂交技术
RNA原位杂交技术

原理：是指具有一定同源性的两条核酸单链在一定 的条件下（适宜的温度和离子强度等）可按碱基互 补原则退火（annealling）形成双链的过程。这一 杂交过程具有高度的特异性。 待测的核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是 未克隆化的基因组DNA核细胞mRNA。 用于检测的已知核酸片段称之为探针（probe）。 常用的标记物包括放射性标记和非放射性标记物两 大类。
10
蛋白质后加样在变性的
DNA测序凝胶中作电泳分 离和放射自显影。结果B 样品DNA片段的5~7部位呈
5
1
A
B
现空白的“足迹”，与A 样品对照后解读出该区段 的核苷酸序列。
DNaseI足迹试验
c.
将这两个质粒共转化于酵母细胞中。
三． 特点
1.
优点 蛋白--蛋白相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。 酵母双杂交系统的建立为研究这一问题提供了有利的手
段和方法。
2. a. b. c.
缺点 它并非对所有蛋白质都适用 假阳性的发生较为频繁来自百度文库 在酵母菌株中大量表达外源蛋白将产生毒性作用，从而
二．
原理
三．
应用
6.3.3 RNAi技术及其应用
一．

概述
RNA干涉(RNA interference，RNAi)是正常生物 体内抑制特定基因表达的一种现象，它是指当 细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链 RNA(dsRNA)时，该mRNA发生降解而导致基因表
达沉默的现象，这种现象发生在转录后水平，
（a）没有加入竞争DNA 的凝胶阻滞实验，探针
DNA与特异蛋白质结合，
出现阻滞条带； （b）加入超量竞争DNA
与探针DNA竞争结合同一
种蛋白质，阻滞条带消失； （c）竞争DNA与探针
DNA分别结合不同的蛋白
质，仍然出现阻滞条带。
图 在凝胶阻滞实验中竞争DNA与探针DNA之间的竞争作用
2. DNaseI足迹试验
条件性基因剔除：对于重要功能基因进行 完全基因敲除会导致胚胎死亡，影响基因 功能研究。因此常用Cre/LoxP和FLP/FRT系 统进行组织特异性敲除。通过定位重组系
统实现特定时间和空间的基因敲除
6.2.2 高等动物基因敲除技术
6.3 蛋白质及RNA相互作用技术
6.3.1 酵母单杂交技术 6.3.2 酵母双杂交技术
影响菌株生长和报告基因的表达。
6.3.1 酵母单杂交技术
一．概述
顺式作用元件
存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列，本 身不编码任何蛋白质，仅仅提供一个作用位点， 与反式作用因子相互作用参与基因表达调控。

反式作用因子
心序列上参与调控靶基因转录效率的蛋白质。
是指能直接或间接地识别或结合在顺式作用元件核
6.3.3 RNAi技术及其应用
6.3.2 酵母双杂交技术

用于分离与已知靶蛋白质相互作用基因的方法
一．
•
原理
许多真核生物的转录激活因子都是由两个可 以分开的、功能上相互独立的结构域(domain) 组成的。 酵母的转录激活因子GAL4

BD (binding domain) AD (activating domain)
加入蛋白质X 1 4 8
加入DNaseI 凝胶电泳放 射自显影
10
（b） 位点5、6、7因受特 异结合蛋白质X的保护而
（b）
*
免受DNaseI的切割作用；
（c） 在上述两个样品中 加入少量的DNaseI，除去 足迹
（c） （a） 双链DNA片段 中只有一条链的5'端被32P标记，上面 带有若干个DNaseI 潜在的切割位点；
用锚定酶和标签酶两种限制性内切酶切割DNA分子的特 定位置(靠近3'端)，分离出短核苷酸序列(9～lObp)。 它包含了该转录本的足够信息。将一个体系的所有转 录本中这一短序列分离并连接到一个克隆载体中进行 测序．便可以得到该体系的所有转录本的表达情况。
二．
1.
操作步骤
以biotin-oligo dT为引物将mRNA反转录合成双链 cDNA，以一种锚定酶（Anchoring Enzyme, AE） 进行酶切后，收集其cDNA的3‘端部分。 将收集的3’端cDNA等分为两部分，分别同接头A、 B相连接。每一种接头的结构都由PCR扩增引物A或 B的序列、标签酶识别位点和锚定酶识别位点三部 分组成。
放射性标记的DNA
*
*
A
B
C
细胞蛋白质提取物
*
凝胶电泳
*
蛋白质与DNA结合
*
B
*
DNA-蛋白质结合 物电泳迁移缓慢
*
* *
*
放射自显影
滞后带表明DNA与 蛋白质结合
凝胶阻滞实验的基本原理图 放射性标记的DNA由于与一种细胞蛋白质B结合，于是在凝 胶电泳中移动速度变慢，在放射自显影中呈现滞后的条带
二．

试验流程
酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通 过两个杂交蛋白在酵母细胞中的相互结合及对报 告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步
骤为:
a.
已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA 结合域融合，构建成诱饵质粒。
b.
将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构 建成文库质粒。

如果有一种蛋白质已经结合到DNA分子的某一特定区段上，那
么，它就将保护这一区段的DNA免受DNaseI的消化作用，因而 也就不可能产生出相应长度的切割条带。在电泳凝胶的放射
自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位是没有放射标记条
带的，出现了一个空白的区域，人们形象地称之为“足迹”
1
5
10
（a） 32p *
在DNaseI足迹试验（DNA foot-printing assay）过 程中，首先将待检测的双链DNA分子用32P作末端标记，并用限 制性内切酶去掉其中的一个末端，得到只有一条链的单个末 端标记的双链DNA分子，与细胞蛋白质提取物混合。待二者结 合之后，再加入少量的DNaseI（它可沿着靶DNA作随机单链切 割）消化DNA分子，并控制酶的用量使之达到平均每条DNA链 只发生一次磷酸二酯键断裂。如果蛋白质提取物中不存在与 DNA结合的特异蛋白质，经DNaseI消化之后便会产生出距放射 性标记末端1个、2个、3个核苷酸等等一系列前后长度均仅相 差一个核苷酸的连续的DNA片段梯度群体。