Chapter4固定化

4.2
（二）结合法
1 共价键结合法☆
4.2
1 共价键结合法
（1）概念-酶分子功能基因和载体的功能基因反应 （2）可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游离 游离氨基， 羧基， 羧基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟 基， 甲硫基， 吲哚基，二硫键 （3）常用载体：天然高分子、人工合成的高聚物、 无机载体
共价键结合法制备固定化酶的“通式” 共价键结合法制备固定化酶的“通式”
首先载体上引进活泼基团； 首先载体上引进活泼基团； 然后活化该活泼基团； 然后活化该活泼基团；
4.2
最后此活泼基团与酶分子上某基团形成共价键。 最后此活泼基团与酶分子上某基团形成共价键。
4.2
（4）载体活化的方法
A．重氮法 B．叠氮法 C．烷基化反应法 C D．硅烷化法 E．溴化氰法
酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联
• 酶分子；
（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶 性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶
4.2
（四） 包埋法
定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载 体中，使酶分子截留在特定网格结构载体 中，反应条件温和，酶活力回收率高。
（1） 操作稳定性提高； ） 操作稳定性提高； （2） 贮存稳定性比游离酶大多数提高； ） 贮存稳定性比游离酶大多数提高； ( 3 ) 对热稳定性，大多数升高，有些反而降低； 对热稳定性，大多数升高，有些反而降低； ( 4 ) 对分解酶的稳定性提高； 对分解酶的稳定性提高； （5） 对变性剂的耐受力升高。 ） 变性剂的耐受力升高。
4.2
无载体固定
可能变化
适用性
酶源多
较广
广泛
较广
4.2
2． 选择方法依据 ．
催化活性和专一性。 （1） 酶——催化活性和专一性。 ） 催化活性和专一性 （2） 载体 结合牢固、 ） 载体——结合牢固、不反应、机械强度。 结合牢固 不反应、机械强度。 （3） 空间位阻小、成本低。 ） 空间位阻小、成本低。
（五）无载体固定化
特点： 特点： 无载体固定化酶不溶于水和有机溶剂，回收方便； 无载体固定化酶不溶于水和有机溶剂，回收方便； 有较高催化剂比面积，较高催化活性； 有较高催化剂比面积，较高催化活性； 稳定性高，对高温、有机溶剂等耐受性高； 稳定性高，对高温、有机溶剂等耐受性高； 溶剂、底物、产物的扩散阻力小。 溶剂、底物、产物的扩散阻力小。 形式： 形式： 交联溶菌酶 交联酶晶体 交联酶聚集体 交联喷雾干燥酶
4.2
3、交联法有三种形式：
酶直接交联法 酶辅助蛋白交联 载体交联法 共交联法 交联酶法
第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶得到一种分子间 交联的固定化酶。
4.2
酶直接交联法
在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。 固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温 度和反应时间之间的平衡。 例子：木瓜蛋白酶 操作简单、固定化条件控制困难、固定化重现性较差、 固定化酶活力回收率相对较低、固定化酶机械强度不足。
（5）载体的选择
一般选用亲水性载体； 一般选用亲水性载体； 载体结构疏松，表面积大，有一定机械强度； 载体结构疏松，表面积大，有一定机械强度；
4.2
载体必须有温和条件下和酶共价结合的功能基团； 载体必须有温和条件下和酶共价结合的功能基团； 载体没有或很少有非专一性吸附； 载体没有或很少有非专一性吸附； 载体来源容易，便宜，并能反复使用。 载体来源容易，便宜，并能反复使用。
（1） 改变酶的空间构象； （2）影响酶催化基团的解离； （3）影响酶结合基团的解离； （4）改变底物解离状态，酶与底物不能结合 或结合后不能生成产物。
4.3
载体电荷的影响
4.3
1） 载体带负电荷，pH向碱性方向移动；载体带正 载体带负电荷，pH向碱性方向移动 向碱性方向移动； 电荷，pH向酸性方向移动 向酸性方向移动。 电荷，pH向酸性方向移动。
Chapter 4 Immobilized enzyme and cell
第四章 固定化酶和细胞
Contents of chapter 4
4.1 概述 4.2 固定化酶的制备 4.3 固定化酶的性质及其影响因素 4.4 固定化细胞 4.5 固定化辅酶和原生质体 固定化酶（细胞） 4.6 固定化酶（细胞）的应用
（一） 吸附法
1、物理吸附：利用各种固体Байду номын сангаас附剂 物理吸附： 固体吸附剂将酶或含 物理吸附 固体吸附剂
酶菌体吸附在其表面上。
4.2
选择载体的原则
（1）要有巨大的比表面积； 1 （2） 要有活泼的表面； （3） 便于装柱进行连续反应。 无机载体（氧化铝、高岭土等）有机载体（纤维素等）
4.2
物理吸附特点
4.2
3、固定化后酶的考察项目： 、固定化后酶的考察项目：
（1） 测定固定化酶的活力、比活，以确定 活力、比活 活力 固定化过程的活力回收率 活力回收率。 活力回收率 （2） 考察固定化酶稳定性、半衰期 稳定性、 稳定性 （3） 考察固定化酶最适反应条件 最适反应条件
4.2
二、酶的固定化方法
（一） 吸附法 （二） 结合法 （三） 交联法 （四） 包埋法 （五）无载体固定法
关键在于选择适当的固定化方法和必要的载体 以及稳定性研究、改进。 1． 四大类方法： ． 四大类方法： 吸附法（物理吸附\离子吸附 离子吸附） 吸附法（物理吸附 离子吸附） 共价结合法（无机多孔材料） 共价结合法（无机多孔材料） 交联法（酶分子交联\酶和载体交联 酶和载体交联） 交联法（酶分子交联 酶和载体交联） 包埋法（凝胶\微胶囊 半透膜\脂质体 纤维） 微胶囊\半透膜 脂质体\纤维 包埋法（凝胶 微胶囊 半透膜 脂质体 纤维）
4.1 概述
酶的缺陷性 固定化技术的发展 固定化酶定义 固定化酶的优缺点
4.1
酶的缺陷性 离开生物细胞，稳定性差； 一次性使用，回收困难； pH、抗原性、自水解作用 产物的分离纯化困难。
4.1
固定化酶技术的发展
60年代起步； 1971年正式命名； 固定化方法和载体的研究 应用
什么是固定化酶？ 什么是固定化酶？
4、最适温度变化 、
4.3
一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。
5、底物特异性变化 、
作用于低分子底物的酶 ，特异性没有明显变化； 既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的 酶， 特异性往往会变化。
6、米氏常数 米氏常数Km值随载体性质变化 米氏常数 值随载体性质变化
（1）载体与底物电荷相反，静电作用， Km’< Km。
4.3
4.3 固定化酶的性质及其影响因素
一、影响固定化酶性质的因素 二、固定化后酶性质的变化 三、评价固定化酶的指标
4.3
一、影响固定化酶性质的因素
1、酶本身的变化 酶本身的变化 主要是由于活性中心的氨基酸残基、 高级结构和电荷状态等发生了变化。
4.3
2．载体的影响 载体的影响
（1）构象效应 ） （2）屏蔽效应、微孔效应、分配效应、 ）屏蔽效应、微孔效应、分配效应、 （3）空间障碍效应、扩散限制效应 ）空间障碍效应、
包埋法分为网格型和微囊型 网格型和微囊型
4.2
1．网格型
(1) 概念 将酶或含酶菌体包埋在凝胶细微网 格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格 型包埋法。也称为凝胶包埋法
2．微囊型包埋法
4.2
是将酶包埋在各种高分子聚合物制成的小球内， 制成固定化酶。由于固定化形成的酶小球直径 一般只有几微米至几百微米，所以也称为微囊 化法。
固定化方法的影响 3. 固定化方法
4.3
二、固定化酶的性质
1、固定化酶活性：多数情况下酶活力下降， 固定化酶活性： 固定化酶活性 反应速度下降。 原因：酶空间构象的变化；空间位阻； 原因 内扩散阻力抑制底物与活性中心接触； 半透膜包围，大分子底物不能与酶接近。
4.3
2、固定化酶稳定性 固定化酶稳定性
各类固定化方法的特点比较
比较项目 吸附法 物理吸附 制备难易 固定化程度 活力回收率 载体再生 费用 底物专一性 易 弱 较高 可能 低 不变 结合法 .共价键 共价键 结合 难 强 低 不可能 高 可变 离子键 结合 易 中等 高 可能 低 不变 较难 强 中等 不可能 中等 可变 较难 强 高 不可能 低 不变 小分子底 物、药用 酶 难 强 高 难 高 交联法 包埋法
4.2
（三）交联法
借助双功能试剂或多功能试剂使酶分子之间、 双功能试剂或多功能试剂使酶分子之间 1、借助双功能试剂或多功能试剂使酶分子之间、 酶分子和惰性蛋白或酶分子和载体间发生交联作 用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。 制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。 网状结构的固定化酶的方法称为交联法 也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。 也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。 常用试剂：戊二醛、异氰酸酯、 2、常用试剂：戊二醛、异氰酸酯、N，N’乙烯马来 乙烯马来 亚胺、双重氮联苯胺等。应用最广泛的是戊二醛， 亚胺、双重氮联苯胺等。应用最广泛的是戊二醛， 它两个醛基都可以与酶或蛋白质的游离氨基形成 席夫碱(shiff)。 席夫碱(shiff)。 (shiff)
4.1
缺点： 缺点
酶活力有损失； 酶活力有损失； 首次投入成本高； 首次投入成本高； 大分子底物较困难，只用于可溶性底物； 大分子底物较困难，只用于可溶性底物； 胞内酶必须经过酶的分离。 胞内酶必须经过酶的分离。
4.2
4.2 固定化酶的制备 一、一般方法及特点 二、 酶的固定化方法
4.2
一、 一般方法及特点
4.3
固定化后酶稳定性提高的原因：
a. 固定化后酶分子与载体多点连接，防止 固定化后酶分子与载体多点连接， 酶分子伸展变形。 酶分子伸展变形。 b. 酶活力的释放是缓慢的。 酶活力的释放是缓慢的。 c. 抑制自降解，提高了酶稳定性。 抑制自降解，提高了酶稳定性。
3、固定化酶 固定化酶pH 固定化酶
4.3
固定化酶的稳定性变化
1—固定化酶；2—天然酶
固定化酶半衰期
酶 固定方法 温 作用时间（d） 度
30 37 37 37 37 37 100 78 73 35 34 40
4.3
剩余酶活 力（%）
50 50 54 50 50 50
青霉素酰化酶 氨基酰化酶 木瓜蛋白酶
烷基法 交联 尼龙（共价） 甲壳脂（吸附） 蔗糖纤维素（共价） 琼脂
4.2
酶辅助蛋白交联
为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰 而引起酶失活，可使用第二个“载体”蛋白质 （即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、血红蛋白 等）来增加蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白质共 交联。 例子：脲酶
4.2
载体交联法
把双功能试剂（戊二醛）一部分功能基团和载 体交联，另一部分功能基团和酶蛋白交联。 例子：尼龙固定木瓜蛋白酶
微环境是指在固定化酶附近的局部环境， 微环境是指在固定化酶附近的局部环境，而把主体溶液称 是指在固定化酶附近的局部环境 宏观环境。 为宏观环境。
4.3
产物性质的影响
催化反应的产物为酸性时，固定化酶的 pH值比游离酶的pH值高；反之则低。
4.3
天冬酰胺酶固定化前后的酶活力-pH曲线
1—固定化酶；2—游离酶
水溶性酶 水不溶性载体 固定化技术 水不溶性酶 （固定化酶） 固定化酶）
4.1
固定化酶的优缺点
优点: 优点
4.1
易将酶与底物、产物分开； 易将酶与底物、产物分开； 较长时间内多次使用（分批或连续反应）； 较长时间内多次使用（分批或连续反应）； 大多数情况下可以提高酶的稳定性； 大多数情况下可以提高酶的稳定性； 酶反应过程能够进行严格控制； 酶反应过程能够进行严格控制； 只能用于可溶性小分子底物，能进行多酶反应； 只能用于可溶性小分子底物，能进行多酶反应； 纯化简单，提高产物质量； 纯化简单，提高产物质量； 应用范围广，使用效率提高，成本降低。 应用范围广，使用效率提高，成本降低。
4.3
（2）载体与底物带相同电荷，Km’> Km，固定 化酶降低了酶的亲和力。
4.3
范德华力、氢键、疏水犍等物理作用吸附； 结合力弱，容易脱落；载体可再生 活性中心不易破坏、高级结构变化少。
4.2
2、离子交换吸附 、
原理： 原理： 利用离子效应，固定到含有离子交换基团的 固相载体。常用阴离子交换介质。在特定的 离子强度和pH条件下，使酶的净电荷与载 体的带电基因之间相互作用。 特点： 特点： 操作简单、结合较为牢固、 离子强度和pH影响较大