外源化学物致突变作用

外源化学物致突变作用
第一节 概 述
遗传与变异（variation）
突变（mutation）
遗传结构本身的变化及引起的可遗传的变异
自发突变（spontaneous mutation）
诱发突变（induced mutation）
致突变作用（mutagenesis）：
广义概念是外来因素，特别是化学因子引起细胞核中的遗传物质发生改变的能力，而且此种改变可随同细胞分裂过程而传递。简单地说，突变的发生及其过程即为致突变作用。
致突变物(mutagen):能够引起突变的物质
direct-acting ～
indirect-acting～

1904 de Vries X 线可改变生殖细胞的遗传物质
1927 H.J.Muller:X线→果蝇性连锁隐性致死突变(起始)
1942 Charlotte Auerbach&J.M.Robson氮芥对果蝇有致突变性 （化学物致突变的首次证据）
1951 Russed 用X线可诱发小鼠突变
1966 Cuttanach 化学物可诱发小鼠突变
50年代末60年代初，突变对健康的影响始被广泛认

遗传毒理学（genetic toxicology）
研究化学性和放射性物质致突变作用及人类接触致突变物可能引起的健康效应；主要研究致突变的作用机制，应用检测系统发现和探究致突变物，提出评价致突变物健康危害的方法

1. DNA与基因
? DNA（deoxyribonucleic acid）:遗传信息储存的大分子物质，由脱氧核糖、磷酸及碱基组成，基本成分为四种核苷酸，形成双螺旋结构
基因: DNA分子中最小的完整功能单位；是能够指导表达并产生某个基因产物（蛋白质或RNA）、在一定条件下产生特定生理功能的DNA序列，包括编码区和调控区两大部分；基本作用是决定蛋白质的一级结构
O.T.Avery等人1944年通过肺炎双球菌转化实验首次证明基因的本质是DNA


染色质 ：间期核内光镜可见的嗜碱性物质
组成：DNA＋组蛋白＋非组蛋白＋少量RNA
染色体：中期细胞核，染色质螺旋并折叠成染色体



3.体细胞和生殖细胞
? 体细胞(somatic cell):二倍体(diploid)，含2组完全相同的染色体，遗传损伤不遗传给下一代
? 生殖细胞(germ cell):单倍体(haploid)，遗传损伤可遗传给下一代



4.基因型与表型

基因型：是控制生物性状的基因组成，是性状发育的内因，表型形成的根据。 用杂交技术鉴定（FISH）

表型：发育过程中由基因控制的生物性状的具体体现；是不同基因之间以及基因与环境之间极其复杂的相互作用结果，基因型只能决定表型可能发育的范围，会产生怎样的表型取决于生物生长发育所处的环境。用理化方法测定




第二节 外源化学物致突变的类型
以光学显微镜分辨率0.2μm来区分基因突变和染色体畸变

一、基因突变

基因突变：基因中DNA序列的变化；点突变(point mutation)

1.碱

基置换（base substitution）
某一碱基配对性能改变或脱落所致的突变。
错误配对(mispairing) 碱基置换
复制

转换（transition)和 颠换（transversion）


错义突变：密码子发生改变，从一种AA变成另一种AA
同义突变：遗传密码子具有兼并性，虽然有碱基置换的发生，但密码子的意义可以没有改变
无义突变:mRNA上的密码子由氨基酸编码密码子变成非编码的终止密码(UAG、UGA、UAA)。基因产物是不完全或是无功能的

2.移码突变（frameshift mutation）
? 指发生一对或几对（3对除外）的碱基增加或减少，以致从受损点开始碱基系列（阅读框架）完全改变，形成错误的密码，并转译成为不正常的氨基酸
? 较易成为致死性突变


正向突变：导致基因产物正常功能丧失的突变
回复突变：使基因产物的功能恢复的突变


? 指染色体结构改变，是遗传物质大的改变，一般可用光学显微镜检查适当细胞有丝分裂中期的染色体来发现。细胞学检测可发现染色体断裂和由断裂所致的各种重排
作用在复制前（G1或G0期）→S期复制→染色体型畸变
作用在S期复制后及G2期→染色单体型畸变





基因组突变，即基因组中染色体数目异常
? 正常二倍体染色体数:人46, 大鼠42,小鼠40,狗78,兔44
? 非整倍体(aneuploidy):增加或减少一条或几条染色体
? 多倍体(polyploid,整倍体euploid):以染色体组为单位的增加


? 染色体数目的改变会导致基因平衡的失调，可能影响细胞的生存或造成形态及功能上的异常。如21三体导致先天愚型(Down氏综合征)。

第三节 化学毒物致突变作用的机制及后果

3.碱基类似物（Base analogs ）取代

影响细胞分裂过程的因素：
纺锤体
微管蛋白的合成与聚合
微管结合蛋白的合成与功能发挥
细胞分裂纺锤纤维的功能发挥
着丝粒与之有关的蛋白质作用
极体复制与分离
减数分裂时同源染色体联合配对与重组

1.同源染色体在减数分裂I期不能适当分离




与微管蛋白二聚体结合：秋水仙碱→与微管蛋白二聚体结合→妨碍微管的正常组装→抑制细胞分裂
与微管巯基结合：苯基汞与着丝粒微管结合，甲基汞与极间微管结合→分裂部分抑制→非整倍体
已组装微管的破坏：秋水仙碱、灰黄霉素、长春新碱→与微管结合蛋白结合→微管解聚
毛地黄皂苷→与微管非特异性结合→蛋白质变性
异丙基-N-氨基甲酸苯酯→微管失去定向能力
中心粒移动受阻：秋水仙碱→中心粒分离和移动
其他：如N2O机制不明

The use of colchicine to generate

a diploid from a monoploid. Colchicine added to mitotic cells during metaphase and anaphase disrupts spindle-fiber formation, preventing the migration of chromatids after the centromere is split. A single cell is created that contains pairs of identical chromosomes that are homozygous at all loci.


DNA复制相关酶、组蛋白和非组蛋白

DNA修复机制的损伤



第四节 机体对致突变作用的影响
DNA可受到自发性化学降解和环境中化学致突变物,辐射等因素影响而损伤,但在所有的物种中均世代相传：
1)DNA执行高保真度的复制;
2)机体已进化有多种机制修复DNA损伤(包括损伤耐受机理和修复机理 )。

个体对致突变物敏感性差异的原因有:
1)代谢酶的遗传多态性;
2)修复能力差异;
3)宿主因素.

直接修复和切除修复
1.直接修复
1).光复活
光裂合酶切除紫外线产生的胸腺嘧啶二聚体；进化程度越高此功能越弱

2)“适应性”反应（O6-甲基鸟嘌呤修复）
O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（胱氨酸残基接受甲基），修复烷基化的鸟嘌呤，可阻止DNA交链形成，在修复过程中不可逆性失活，但该酶具诱导性
2.切除修复
1)核苷酸切除修复
(nucleotide excision repair, NER)
内切酶在损伤部位两端切断（水解核酸损伤部位）→解螺旋酶除去受损寡核苷酸，形成缺口→DNA聚合酶I从缺口5’→3’延长DNA链（修复聚合酶正确填补）→DNA连接酶封闭裂口磷酸二酯键,完成修复



2)碱基切除修复
(base excision repair, BER)
? DNA糖基酶识别、水解受损碱基→受损碱基脱落→AP位点→AP内切酶切断与受损碱基连接的脱氧核糖→聚合酶、连接酶完成修复

3.错配修复（mismatch repair, MMR）
? 识别、去除错配的碱基对（G：T，A：C）

4. 双链断裂修复
同源重组或者非同源性末端连接机制


5.交联修复
1）无误交联修复
降解双螺旋，使链内交联转变为链内二核苷酸加合物接连于双链断裂处，随后Hollidy连接体分解，核苷酸切除修复最终去除二核苷酸交联
2）易误交联修复
化学致突变作用的模式:

损伤-修复-突变模式
二、遗传因素对致突变作用的影响



(一) 代谢酶遗传多态性
遗传多态性(genetic polymorphysm )
是一个衡量遗传变异的数据,即群体中多态基因的比例。多态性的标准是,当一个基因座位的最常见的等位基因频率不超过0.99时,这个基因座位即是多态性。
(二) 修复功能的个体差异
1.O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)
组织差异和个体差异
MGMT多态性可解释某些个体对烷化剂作用特别敏感
2. 聚(二磷酸腺苷-核糖)多聚酶(PARP)
第五节 观察化学毒物致突变作用的基本方法
一、 观察项目的选择
1.

观察的效应终点类型
致突变试验的观察终点称遗传学终点(genetic endpoint )
①基因突变;
②染色体畸变;
③染色体组畸变;
④DNA原始损伤。

2.成套的观察项目
试验入选原则:
① 一组可靠的试验系统应包括每一类型的遗传学终点。
②实验材料应包括多种进化程度不同的物种
③体内试验与体外试验配合
二、常用的致突变实验
(一) 细菌回复突变试验(Ames试验)
(二) 微核试验
(三) 染色体畸变分析
(四) 姐妹染色单体交换试验
(五) 果蝇伴性隐性致死试验
(六)显性致死试验
(七)程序外DNA合成试验
(八)单细胞凝胶电泳试验

1.细菌回复突变试验（Ames试验 ）
Ames试验（1979美加州大学Ames BN）
正向突变
野生型（his＋） 突变型（his－）
回复突变 ↑±S9
待测化学物
正向突变试验
利用培养的哺乳动物细胞系如小鼠淋巴瘤L5178Y细胞系和中国仓鼠肺(V79)细胞株,观察特定基因座位(locus )上是否诱变产生突变体
最常用的基因座是hprt 和tk
可检测座位内的碱基置换、缺失、移码和重排等点突变

微核(micronucleus)与染色体损伤有关,是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色体,在细胞分裂后期遗留在细胞质中,末期之后,单独形成一个或几个规则的次核,包含在子细胞的胞质内,因比主核小,故称微核 。
来源：一是断片或无着丝粒染色体在细胞分裂后期不能定向移动,留在细胞质中;二是有丝分裂毒物作用使个别染色体或带着丝粒染色体环和断片在细胞分裂后期被留在细胞质中



方法进展：
1）体外MNT:
常用细胞有中国仓鼠肺细胞（CHL）,中国仓鼠卵巢细胞（CHO）及V79
2）周围血微核试验
3）双核细胞法(胞质分裂阻断法)
4）免疫荧光染色法和荧光原位杂交法 (FISH)

观察染色体形态结构和数目改变称为染色体畸变分析(chromosome aberration analysis),又称细胞遗传学试验(cytogenetic assay )


SCE：染色体同源座位上DNA复制产物的相互交换，其频率与DNA断裂和重接有关






隐性基因在伴性遗传中具有交叉遗传特征
野生型雄蝇：圆形红色眼； Basc雌蝇：棒形杏色眼
P1 ♂ ┆↑ × ││♀
↓
F1 ♂ │↑ × ┆│♀（杂合型，不表达）
↓
F2 ♂┆↑(表达) ♂│↑(棒形杏红眼) ┆│♀ ││♀
阳性结果有高度实用价值
可检出点突变、小缺失、重排


7.程序外DNA合成实验（UDS）

? 当DNA损伤时,即会发生在S

期半保留DNA程序合成之外的DNA合成,称之为程序外DNA合成(unscheduled DNAsynthesis),它是机体为保证其遗传特征的高度稳定而对DNA双链上出现的变异或损伤进行修复合成的过程

? 同步培养将细胞阻断在G1期，且阻断正常的DNA半保留复制，后接触受试物，检测掺入DNA的3H-TdR的放射活性

8.单细胞凝胶电泳（SCGE）试验 comet assay

? 单细胞水平上检测有核细胞DNA损伤和修复的方法

1）转基因动物致突变试验
（transgenic animal mutagenicity assay）
在小鼠体内导入对外源化学物敏感性高的目的基因，用以检测化学物对靶基因的致突变作用
转基因动物：基因组中整合有用实验方法导入的稳定的DNA，并能遗传给后代的动物

2）微核自动化检测技术
流式细胞仪和图像分析系统
染毒→采血→Percoll梯度离心→纯化红细胞→戊二醛固定 染色（Hoechst33342染DNA：蓝光，TO染RNA：绿光） →流式细胞仪检测：
含微核PCE细胞：绿光＋蓝光；
PCE细胞：绿光；
含微核NCE细胞：蓝光；
NCE细胞：不发光

比较研究显示，在检测断裂剂方面，MNT与CA结果有很好相关，在质和量上均如此


3）荧光原位杂交技术（FISH）





1.阳性和阴性对照的设立
消除或减少实验误差
2.体外试验的活化系统
加入代谢活化系统以检出前致突变物
（1）哺乳动物细胞介导：使用完整的细胞，特别是大鼠肝原代细胞。有完整的细胞结构和各种酶及内源性辅助因子
（2）S9：经酶诱导剂处理后制备的肝匀浆，再经9000g离心所得上清
（3）纯化酶和基因工程

3.致突变试验与致癌试验的关系
? 遗传毒性致癌物
? 非遗传毒性致癌物
? 遗传毒性非致癌物
? 非遗传毒性非致癌物

4.试验结果在毒理学安全性评价中的作用
? 质控措施：阴性和阳性对照；盲法观察；统计学分析；重现性
? 阴性结果判定条件：最高剂量；组距不应过大
? 阳性结果：统计分析，剂量－反应关系；与阴性对照比较有显著性差异