透明质酸生产工艺

透明质酸的生产
郭学平凌沛学王春喜张天民
透明质酸是一种酸性黏多糖，广泛存在于动物的组织细胞间质（基质）和某些细菌的荚膜中。

1934年Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质，并命名为hyaluronic acid（HA）。

HA由葡糖醛酸和N-乙酰氨基葡糖组成的双糖单位构建成的直链多糖，相对分子质量（Ｍr）为（1~10）×105。

HA的生产工艺主要分为两大类，以动物组织为原料的提取法和细菌发酵法。

几乎所有的动物组织中均含有HA，只是含量不同，能够用于生产的原料主要为鸡冠和人脐带。

细菌发酵法是利用某些种属的链球菌在生长繁殖过程中，向胞外分泌以HA为主要成分的荚膜。

细菌发酵法与动物组织提法相比，具有生产规模不受动物原料限制，发酵液中HA以游离状态存在，易于分离纯化，成本低，易于形成规模化工业生产，无动物来源的致病病毒污染的危险等优点。

HA无种属差异，不同动物组织提取的及不同菌种发酵生产的HA，在化学本质和分子结构上是一致的，只是Ｍr有差别。

1以雄鸡冠为原料的生产工艺[1，2]
1.1 工艺过程[1，2]
冻鸡冠解冻后，用绞肉机绞碎，加适量水用胶体磨磨成糊状，按每1kg 鸡冠加水8L，加氯化钠80g，搅拌加热至90℃，保温10min，冷却至50℃，用1mol/L氢氧化钠液调pH8.5~9.0，加入适量胰酶，45℃~50℃保温酶解5h~7h，酶解过程中维持pH8.5~9.0。

将酶解提取液用滤布加硅藻土加压过滤，得澄清滤液。

取滤液，调pH6.0~6.5，将滤液加到3倍体积的95%乙醇中，反复倾倒3次，待纤维状沉淀充分上浮后，取出沉淀，用适量乙醇脱水3~5次，真空干
燥，得HA中间品。

将HA中间品溶于0.1mol/L氯化钠溶液中，溶解浓度为0.3%，溶解过程中加少量氯仿防腐。

溶解后，调pH4.5~5.0，加入等体积的氯仿搅拌处理2次，静置分出水相。

将水相用稀氢氧化钠溶液调pH7.5，加入适量链霉蛋白酶，37℃酶解24h。

酶解结束后，向酶解液中加入同体积的1%氯化十六烷基吡啶（CPC）溶液，静置，收集HA-CPC络合沉淀。

将HA-CPC 络合沉淀加入0.4mol/L氯化钠溶液中，搅拌解离5h~10h。

解离液先用硅藻土过滤至清，再用0.2μm微孔滤膜精滤。

将滤液加至3倍体积的95%乙醇中，反复倾倒3次，取出纤维状HA沉淀，脱水，真空干燥，得药用HA精品。

1.2 工艺说明与讨论
鸡冠绞碎后用胶体磨处理时，注意不要磨得太细，以减少机械剪切力对HA的降解。

磨成糊状后，酶解和提取同时进行，提取效率高。

提取时，在水中加入1%的氯化钠。

加热至90℃可对原料有一定灭菌作用，并使蛋白质热变性，易被蛋白酶水解。

所用的蛋白水解酶为胰酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶等。

公鸡冠中的HA与蛋白质以结合状态存在，酶解的另一重要作用是切断HA与蛋白质分子的结合。

提取和酶解时，应注意防腐。

醇沉淀是分离提纯HA、肝素、硫酸软骨素等最常用的方法之一，在制备过程中，可多次重复使用，类似于重结晶的作用。

在从水溶液中用甲醇或乙醇沉淀HA或其它黏多糖时，必须有盐的存在，一般为1%左右的氯化钠。

沉淀形态有纤维状和无定型粉末状两种形态，纤维状HA容易制备，形态疏松，易于脱水和真空干燥，缺点是使用时，溶解速度慢。

制备无定型粉末状沉淀，需控制料液的盐浓度、料液和乙醇的混合速度及搅拌速度等诸多因素，工艺
较复杂，但粉末状HA溶解速度快，使用方便。

第一次乙醇沉淀、脱水、真空干燥所得HA产品，可作为化妆品用保湿剂。

进行进一步精制时，可以使用干燥的产品，也可使用乙醇沉淀后未干燥的产品，这样可以缩短生产周期。

氯仿可使蛋白变性沉淀，利用此作用可除去一部分蛋白质杂质。

氯仿处理的另一个重要的作用，是除去致炎物质。

可反复多次进行氯仿处理。

CPC络合沉淀与解离步骤是分离提纯酸性黏多糖常用的方法之一，特点是纯化效率高、回收率高，可以从很低浓度的溶液中将HA或其它酸性黏多糖沉淀出来。

在低盐浓度下，HA与CPC络合沉淀，在高盐浓度下，HA-CPC 络合物解离溶解。

利用这一性质，可除去不能与CPC络合并沉淀的杂质。

HA在干燥之前要充分脱水，否则有机溶剂挥发后，残存的水分过多，会导致被干燥的产品黏结，不易于干燥，干燥时间延长，干燥后产品变硬、变黄。

脱水所用的溶剂为95%乙醇、无水乙醇、丙酮等。

丙酮的沸点低，用丙酮脱水易于干燥，但干燥后的产品带有特殊气味。

干燥的产品量较少时，可采用静止状态下，加五氧化二磷进行常温真空干燥；产品量较多时，可采用动态的真空干燥。

从雄鸡冠提取HA，产品的M r和收率与鸡的品种及生长期有很大的关系。

生长期在一年以上的雄鸡，尤其鸡冠较大的，产品的M r可达2×106，HA中间品的收率以鸡冠湿重计在1%左右，从中间品到药用精品的纯化收率为50%~70%。

药用精品的纯度以葡糖醛酸计可达46%以上（纯HA的葡糖醛酸含量为48.37%），蛋白质含量低于0.1%。

目前国际上提取的注射级HA的质量水平为：葡糖醛酸含量大于46%，M r大于1.5×106，蛋白质含量小于0.1%，
内毒素含量小于0.2EU/mg。

2 细菌发酵法生产工艺
2.1 工艺过程[3~5]
取斜面菌种，接种于装有灭菌培养液锥形瓶中，37℃培养12h~16h，接种于种子罐中。

培养液中氮源为蛋白胨、牛肉浸膏、酵母膏等，碳源为葡萄糖。

37℃搅拌培养12h~16h，接种于发酵罐中。

接种比例1：10。

发酵液配方基本与种子液相同，只是葡萄糖含量较高，一般为3%~6%。

维持通气量0.3vvm~1.0vvm，搅拌转速120r/min，37℃发酵40h~46h。

在发酵过程中，发酵液的pH值不断下降，需调pH6.5~7.0。

发酵后期，葡萄糖浓度下降至0.5%以下，pH值下降很慢或不再下降时，即为发酵终点。

发酵结束，用三氯乙酸调pH4.0~4.5，板框过滤除菌体，滤液调pH6.0~6.5，加3倍体积95%乙醇，沉淀出HA。

沉淀用发酵体积的0.1mol/L氯化钠水溶液溶解，在搅拌下，加入过量的1%CPC与滤液中的HA发生络合沉淀，静置使沉淀下沉。

虹吸出母液，加入0.1mol/L氯化钠液洗涤沉淀两次。

沉淀在发酵体积的0.4mol/L氯化钠液中搅拌解离过夜。

过滤，滤液加乙醇沉淀，乙醇脱水，真空干燥得HA。

2.2工艺说明与讨论
早在1937年，Kendall等[6]就发现链球菌可产生HA，许多人对此进行了研究。

链球菌属的多种细菌具有荚膜，这种荚膜的主要成分就是HA。

链球菌在生长过程中，荚膜的产生有几种不同的情况，有的菌株在整个生长期都有荚膜，有的在对数生长期的前段产生，后段消失，或稳定期消失，有的根本不产生荚膜。

进一步的研究发现这与菌种是否产生HA酶有密切关系，荚膜
的消失是由于被酶水解。

MacLennan[7]根据是否产生HA和HA酶，将具有荚膜的链球菌C组分为三类：1）只产生HA，不产生HA酶；2）HA和HA酶都产生；3）只产生HA酶，不产生HA。

因此，HA酶的产生对HA的发酵非常不利，在菌种筛选时，要注意观察判断菌种是否同时产生HA酶。

可产生HA的链球菌多为A组和C组，A组中主要有酿脓链球菌等，由于致病性较强，较少用作菌种进行大规模发酵；C组致病性较弱，多采用此类菌，主要有兽疫链球菌、马链球菌和类马链球菌等。

发酵生产HA所用的菌种，一般是将产生HA的链球菌进行诱变处理得到，诱变方法有紫外线照射、化学诱变剂处理等。

除链球菌外，还有Pasteurella multocida可产生HA[8]。

早期对链球菌荚膜HA的研究，主要是为了探索链球菌的荚膜组成和其作用[9~11]及实验室少量制备等，以工业化生产为目的的发酵HA研究始于80年代初期[12]，在借鉴前人对某些链球菌产生HA荚膜这一重要发现，利用现代液体深层发酵技术和设备，对菌种、培养基、各种发酵参数条件进行了优化，并对细菌生物合成HA的代谢过程进行了深入研究，阐明了HA在菌体内的合成路线，使发酵产率和HA的Ｍr有了大幅度的提高，发酵法已成为HA生产的主流工艺。

链球菌的营养需求较高，通常需含血清、小牛肉浸出液（veal infusion broth）、脑心浸出液（brain heart infusion）等培养基，菌体才能较好地生长，但这类营养物质价格昂贵，大规模生产中用其作为培养基，成本太高。

所以在选择菌种时，要考虑其营养需求及所用培养基的成本问题。

发酵生产HA所用的培养基，氮源为蛋白胨、酪蛋白水解液、酵母膏或浸出粉、牛肉浸膏、大豆蛋白水解液、尿素、无机铵盐等。

其中酵母膏最常用，除了作为氮源外，还含
有多种维生素和生长因子，有些是链球菌生长所必需的。

在发酵液中添加一定量的谷氨酸和精氨酸[13]，可以提高HA的产率。

碳源主要是各种单糖、蔗糖和淀粉水解物，最常用的是葡萄糖。

其他还有磷酸盐、硫酸盐，钾、钠、钙、镁等无机盐，铁、锰、铜、锌等微量元素。

链球菌属于兼性厌氧菌。

在HA的发酵工艺中，大多数采用有氧发酵，也有的采用厌氧发酵。

根据HA生物合成路线，有氧发酵的葡萄糖能量代谢可产生更多的A TP，有利于UTP生成，而UTP是合成HA的两个活化前提物，即UDP-葡糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡糖所必需的物质。

因此从代谢调控的角度来说，有氧发酵有利于HA的合成。

Nimrod等[14]用兽疫链球菌的一个变异菌株进行发酵，在厌氧条件下，HA的产率为2g/L；在通气条件下，为4g/L~6g/L。

在发酵过程中通常保持一个适当的溶氧量，也可在不同阶段采用不同的溶氧量。

通过增加通气量和提高搅拌转速可提高发酵液的溶氧，但转速过快可导致HA的机械降解。

在HA的发酵过程中，pH值是一个重要的因素，一般控制在6.0~8.5范围内，最好在7.0左右。

链球菌是一种乳酸菌，产生乳酸等小分子有机酸，需用碱液进行中和，以维持适当的pH值。

在摇瓶和种子罐培养阶段，温度一般控制在37℃。

发酵温度一般为37℃，也有的采用35℃或33℃等较低的温度，或在不同的阶段采用不同的温度。

在种子培养阶段和发酵的初期，37℃培养可使菌体较快的生长繁殖，发酵中期和后期可适当降低温度，据报道可使葡萄糖的代谢方向由合成菌体细胞壁转向合成HA，提高HA的产率。

药用级HA的Ｍr要求较高，发酵法生产的HA的平均Ｍr为（1~4）×106，
人们试图通过葡萄糖的代谢调控，来提高HA的Ｍr。

Kitchen[16]等发现从成纤维细胞分离出的HA合成酶的半衰期仅有2h~4h，大约相当于一条HA分子链的合成时间，于是推断：一个HA分子的Ｍr或链长度，取决于合成它的合成酶在其生命期内可聚合前提物分子（UDP-葡糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡糖）的数量。

根据这一理论，菌体过多的表达HA合成酶，酶分子之间会竞争同一前提物资源，导致HAＭr的降低。

研究发现，低发酵温度（28℃），通气和高初始浓度的葡萄糖（40g/L）可产生高Ｍr的HA，而发酵液pH值和搅拌速度对HA的Ｍr基本无影响。

发酵液中的HA在菌体外的溶液中游离存在，进行下游分离纯化时，首先杀灭和除去发酵液中的菌体，通常加入杀菌剂或75℃~80℃加热进行灭菌。

最常用的杀菌剂为三氯乙酸和阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）。

HA 的含量较高时，发酵液的黏度很高，直接过滤或离心除菌体非常困难，需要先进行稀释。

除菌体后的清液，经乙醇沉淀、氯仿处理、CPC沉淀、离子交换、超滤等方法进行分离纯化，最后用有机溶剂沉淀、真空干燥或冷冻干燥制得HA精品。

这些方法与前述从动物组织提取时的分离纯化方法基本一致。

目前国内HA的发酵产率为4g/L~5g/L，从发酵液到最终产品的纯化收率为60%~70%。

国际先进的HA发酵产率为6 g/L ~7g/L。

发酵法是HA生产的发展方向，应从提高产率、提高产品Ｍr和分离纯化技术方面进一步深入研究。

参考文献
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2沈渤江，张天民．医药工业，1986，（7）：291
3郭学平，王春喜，崔大鹏．日用化学工业，1994，（2）：47
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9MacLennan AP．J Gen Microbiol, 1956, 14:134
10Woolcock JB．J Gen Microbiol, 1974, 85:372
11Edward A, Mortimer JR, Ellen LV．J Bacteriol, 1967, 94:268
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13宫崎俊範，大内博志，新谷康一，等．ヒアルロン酸の新规制造方法．公开特许公报，昭62-289198，1987
14NimrodA, GreenmanB, KannerD．High molecular weight sodium hyaluronate．USP 4, 784, 990, 1988
[原文发表于：药物生物技术，2000，7（1）：61～64]。