透明质酸生产工艺

透明质酸的生产

郭学平凌沛学王春喜张天民

透明质酸是一种酸性黏多糖，广泛存在于动物的组织细胞间质（基质）和某些细菌的荚膜中。1934年Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质，并命名为hyaluronic acid（HA）。HA由葡糖醛酸和N-乙酰氨基葡糖组成的双糖单位构建成的直链多糖，相对分子质量（Ｍr）为（1~10）×105。HA的生产工艺主要分为两大类，以动物组织为原料的提取法和细菌发酵法。几乎所有的动物组织中均含有HA，只是含量不同，能够用于生产的原料主要为鸡冠和人脐带。细菌发酵法是利用某些种属的链球菌在生长繁殖过程中，向胞外分泌以HA为主要成分的荚膜。细菌发酵法与动物组织提法相比，具有生产规模不受动物原料限制，发酵液中HA以游离状态存在，易于分离纯化，成本低，易于形成规模化工业生产，无动物来源的致病病毒污染的危险等优点。HA无种属差异，不同动物组织提取的及不同菌种发酵生产的HA，在化学本质和分子结构上是一致的，只是Ｍr有差别。

1以雄鸡冠为原料的生产工艺[1，2]

1.1 工艺过程[1，2]

冻鸡冠解冻后，用绞肉机绞碎，加适量水用胶体磨磨成糊状，按每1kg 鸡冠加水8L，加氯化钠80g，搅拌加热至90℃，保温10min，冷却至50℃，用1mol/L氢氧化钠液调pH8.5~9.0，加入适量胰酶，45℃~50℃保温酶解5h~7h，酶解过程中维持pH8.5~9.0。将酶解提取液用滤布加硅藻土加压过滤，得澄清滤液。取滤液，调pH6.0~6.5，将滤液加到3倍体积的95%乙醇中，反复倾倒3次，待纤维状沉淀充分上浮后，取出沉淀，用适量乙醇脱水3~5次，真空干

燥，得HA中间品。将HA中间品溶于0.1mol/L氯化钠溶液中，溶解浓度为0.3%，溶解过程中加少量氯仿防腐。溶解后，调pH4.5~5.0，加入等体积的氯仿搅拌处理2次，静置分出水相。将水相用稀氢氧化钠溶液调pH7.5，加入适量链霉蛋白酶，37℃酶解24h。酶解结束后，向酶解液中加入同体积的1%氯化十六烷基吡啶（CPC）溶液，静置，收集HA-CPC络合沉淀。将HA-CPC 络合沉淀加入0.4mol/L氯化钠溶液中，搅拌解离5h~10h。解离液先用硅藻土过滤至清，再用0.2μm微孔滤膜精滤。将滤液加至3倍体积的95%乙醇中，反复倾倒3次，取出纤维状HA沉淀，脱水，真空干燥，得药用HA精品。1.2 工艺说明与讨论

鸡冠绞碎后用胶体磨处理时，注意不要磨得太细，以减少机械剪切力对HA的降解。磨成糊状后，酶解和提取同时进行，提取效率高。提取时，在水中加入1%的氯化钠。加热至90℃可对原料有一定灭菌作用，并使蛋白质热变性，易被蛋白酶水解。所用的蛋白水解酶为胰酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶等。公鸡冠中的HA与蛋白质以结合状态存在，酶解的另一重要作用是切断HA与蛋白质分子的结合。提取和酶解时，应注意防腐。

醇沉淀是分离提纯HA、肝素、硫酸软骨素等最常用的方法之一，在制备过程中，可多次重复使用，类似于重结晶的作用。在从水溶液中用甲醇或乙醇沉淀HA或其它黏多糖时，必须有盐的存在，一般为1%左右的氯化钠。沉淀形态有纤维状和无定型粉末状两种形态，纤维状HA容易制备，形态疏松，易于脱水和真空干燥，缺点是使用时，溶解速度慢。制备无定型粉末状沉淀，需控制料液的盐浓度、料液和乙醇的混合速度及搅拌速度等诸多因素，工艺

较复杂，但粉末状HA溶解速度快，使用方便。

第一次乙醇沉淀、脱水、真空干燥所得HA产品，可作为化妆品用保湿剂。进行进一步精制时，可以使用干燥的产品，也可使用乙醇沉淀后未干燥的产品，这样可以缩短生产周期。

氯仿可使蛋白变性沉淀，利用此作用可除去一部分蛋白质杂质。氯仿处理的另一个重要的作用，是除去致炎物质。可反复多次进行氯仿处理。

CPC络合沉淀与解离步骤是分离提纯酸性黏多糖常用的方法之一，特点是纯化效率高、回收率高，可以从很低浓度的溶液中将HA或其它酸性黏多糖沉淀出来。在低盐浓度下，HA与CPC络合沉淀，在高盐浓度下，HA-CPC 络合物解离溶解。利用这一性质，可除去不能与CPC络合并沉淀的杂质。

HA在干燥之前要充分脱水，否则有机溶剂挥发后，残存的水分过多，会导致被干燥的产品黏结，不易于干燥，干燥时间延长，干燥后产品变硬、变黄。脱水所用的溶剂为95%乙醇、无水乙醇、丙酮等。丙酮的沸点低，用丙酮脱水易于干燥，但干燥后的产品带有特殊气味。干燥的产品量较少时，可采用静止状态下，加五氧化二磷进行常温真空干燥；产品量较多时，可采用动态的真空干燥。

从雄鸡冠提取HA，产品的M r和收率与鸡的品种及生长期有很大的关系。生长期在一年以上的雄鸡，尤其鸡冠较大的，产品的M r可达2×106，HA中间品的收率以鸡冠湿重计在1%左右，从中间品到药用精品的纯化收率为50%~70%。药用精品的纯度以葡糖醛酸计可达46%以上（纯HA的葡糖醛酸含量为48.37%），蛋白质含量低于0.1%。目前国际上提取的注射级HA的质量水平为：葡糖醛酸含量大于46%，M r大于1.5×106，蛋白质含量小于0.1%，

内毒素含量小于0.2EU/mg。

2 细菌发酵法生产工艺

2.1 工艺过程[3~5]

取斜面菌种，接种于装有灭菌培养液锥形瓶中，37℃培养12h~16h，接种于种子罐中。培养液中氮源为蛋白胨、牛肉浸膏、酵母膏等，碳源为葡萄糖。37℃搅拌培养12h~16h，接种于发酵罐中。接种比例1：10。发酵液配方基本与种子液相同，只是葡萄糖含量较高，一般为3%~6%。维持通气量0.3vvm~1.0vvm，搅拌转速120r/min，37℃发酵40h~46h。在发酵过程中，发酵液的pH值不断下降，需调pH6.5~7.0。发酵后期，葡萄糖浓度下降至0.5%以下，pH值下降很慢或不再下降时，即为发酵终点。

发酵结束，用三氯乙酸调pH4.0~4.5，板框过滤除菌体，滤液调pH6.0~6.5，加3倍体积95%乙醇，沉淀出HA。沉淀用发酵体积的0.1mol/L氯化钠水溶液溶解，在搅拌下，加入过量的1%CPC与滤液中的HA发生络合沉淀，静置使沉淀下沉。虹吸出母液，加入0.1mol/L氯化钠液洗涤沉淀两次。沉淀在发酵体积的0.4mol/L氯化钠液中搅拌解离过夜。过滤，滤液加乙醇沉淀，乙醇脱水，真空干燥得HA。

2.2工艺说明与讨论

早在1937年，Kendall等[6]就发现链球菌可产生HA，许多人对此进行了研究。链球菌属的多种细菌具有荚膜，这种荚膜的主要成分就是HA。链球菌在生长过程中，荚膜的产生有几种不同的情况，有的菌株在整个生长期都有荚膜，有的在对数生长期的前段产生，后段消失，或稳定期消失，有的根本不产生荚膜。进一步的研究发现这与菌种是否产生HA酶有密切关系，荚膜