薄层扫描法

薄层扫描法

一、定义

薄层扫描法(TLCS)又称原位定量薄层色谱扫描法（QTLC）系指用一定的波长的光照射在薄层板上，对薄层色谱中有紫外或可见吸收的斑点或经照射能激发产生荧光斑点进行扫描，将扫描得到的图谱及积分值用于药品定性定量的分析方法。

回顾薄层色谱法（TLC)

1、薄层板的制备（硅胶板,Al2O3板，聚酰胺薄膜等）

2、点样（选择合适的展开剂，在薄板底1cm处画基线，点样）

3、展开（浸入展开剂，展开到距薄板顶端1~2cm)

4、检视(在紫外光灯下观察斑点）

了解一下薄层扫描仪

薄层扫描仪的组成及主要功能

薄层色谱扫描仪有多个厂家生产，型号不同，仪器外形、光路系统及某些功能也有差异，但其基本结构及主要功能是基本相同的。每台仪器都包括主机、数据处理及信号输出等部分。

（1）分光器及测量范围

大多数薄层扫描仪的分光器为光栅，少数为棱镜，极个别的用滤光片，其测量范围光栅为200-800nm，棱镜为200-2500nm。

（2）光源及检测器

光源室具有可见光源钨灯，波长范围为400-800，紫外光源氘灯波长范围为200-400nm，荧光光源为氙灯或汞灯。操作时可通过光源选择杆来变换光源选择

镜的位置；检测器一般为光电倍增管。

表7-5-2 国外几种主要专用薄层色谱扫描仪

二、TLCS基本原理与方法

薄层扫描法可分为薄层吸收扫描及薄层荧光扫描两类方法。

1. 薄层吸收扫描法的基本原理

薄层吸收扫描法是用可见光或紫外线的单色光照射展开后的薄层色谱板，测定薄层色谱斑点(简称斑点)的吸光度(A)随展开压离(L)的变化，而获得A —L成A—Rf曲线，即薄层色谱扫描图(简称扫描图)。

曲线上的色谱峰峰面积可用于定量分析。由于薄层板存在着明显的散射现象，而使斑点中物质的浓度与吸光度的关系不服从Beer定律，所以需田Kubelka—Munk(古柏尔卡—曼克)理论来描述。该方程式是薄层扫描法的定量分析基础。定量校正方法可分为曲线校直法及非线性回归法等。

设薄板固定相的厚度为X,入射光的强度为I.,当透过厚度x的的固定相后，照射在微分薄层厚度dx上的入射光强与反射光强分别为i和j时，如左图。其入射光强的增量与反射光强的增量分别符合以下两个微分方程：

即光照射到厚度为x的薄层后，光被吸收及散射。在入射方向，光强度因为被吸收与散射而减弱；在入射的反方向，则光强度因散射而增强。解上述方程得：

在薄层扫描时，人们只是对进入薄层和由薄层出来的光有兴趣，也即上式的极端情况，x=0及x=X时

对比两图很易发现，由于薄层固定相的散射作用使在透射法中所测得的斑点的吸光度产生正偏差，而在反射法测定时产生负偏差。这是因为照射光被散射，降低了透射率，吸光度增加；散射光增加了反射光光强，增加了反射率，而降低了吸光度的缘故。其次，还可发现后图比前图的横座标大25倍，这说明了反

射法的灵敏度(响应值)比透过法小。

1·1 Kubelka-Munk曲线校直

Kubelka－Munk曲线说明了薄层色谱斑点的吸光度与其浓度间呈非线性关系，该曲线是薄层扫描法进行定量分析的理论依据。曲线处理采用两类方法：曲线校直法及计算机回归法(线性及非线性回归)。CS系列仪器采用前者，CAMAG仪器采用后者方法。

曲线校直法是根据薄层板的散射参数SX值，将Kubelka－Munk曲线校正为直线，简化A与KX间的关系，以利于定量分析。

用曲线校正法校直Kubelka—Munk曲线，必须巳知薄层板的SX值，Mrck预制硅胶板的SX＝3，Merck预制氧化铝板的SX＝7，Wako预制硅胶FM(硅胶GF254)板的SX＝7。国产预制薄层板及自制薄层板，可参考上述数据试调，而后检查校正是否适宜，修正SX值再校，直至A—KX曲线成直线为止。检查方法如下图所示。图中点样量显(横坐标)常用单位为ug/点。

应用时应注意：

曲线校直法是一种简便的薄层扫描定量校准方法，但比较粗糙，且有时难于准确知道薄层板的SX值。为了降低定量误差，应使标准品的色谱峰峰面积与待测品(供试品)的色谱峰面积尽量接近为好。

2. 薄层吸收扫描法的扫描方式及条件的选择

薄层吸收扫描法的扫描条件，包括扫描方式、波长及测光方式等。扫描方式分为直线式及锯齿式扫描。扫描波长的选择至关重要，不仅关系检测灵敏度，而且关系干扰的排除等。测光方式分为透射式及反射式

2.1 扫描方式选择

(1) 直线扫描

直线式扫描是用一光带先照射在薄层板的一端，而后作直线运动至另—端。在作直线式扫描时，实际上是光带固定，薄层板相对于光带作直线运动。

在作直线扫描时，光带的长度对扫描后所得的色诺峰峰面积影响很大，下图说明了光带越长，所得的色谱蜂面积越小，反之则峰面积越大。光带太长，检测灵敏度低，光带太短，光带只通过斑点的一部分，所得的蜂面积，不能真实反砍斑点的吸收情况。因此，正常扫描时，应使光带长度略大于斑点直径。在多斑点扫描的，光带长度略大于最大斑点直径。为了降低定量误差，应使标准品

斑点的直径与检品斑点的直径尽量接近。样品斑点为带状时，光带长度应约为样带的2/3。

不规则斑点，用直线式扫描定量，即使光带长度适宜，定量误差仍然较大，因为所得峰面积还与扫描方向有关。

综上所述，直线式扫描较适用于规则圆形薄层色谱斑点及条状薄层色谱斑点的定量分析。所能测定斑点的大小，以仪器的光带长度为上限。例CS—930薄层扫描仪，出射狭缝最大长度(高度)为6mm，只能测定小于6mm的斑点。在作直线式扫描叫，光带的步进距离ΔY也影响蜂面积。斑点小应选小步进距离，选择适宜，能降低定量误差。有关TLC及HPTLC板的光带长度及步进距离的具体选择见表。

(2)锯齿式扫描

用截面积为正方形的光束照射薄层板，光束的运动轨迹为矩齿形。CS 系列的摆动距阂最大为30mm，因此锯齿式扫描适用于直径小于30mm的斑点。

直线式扫在做锯齿形扫描时，由于光束来回通过斑点，吸光度积分值比描大，重复性较好。

锯齿扫描还适用于不规则斑点的定量。虽然扫描方向不同时，所得的色谱峰形状有差别，但积分值差别较小。

机械锯齿式描仪器扫描速度慢是其缺点，飞点扫描型仪器(如CS－9000型薄层扫描仪)则克服了此缺点。

(3) 双校长法的优点