雷公藤红素逆转K562_A02细胞多药耐药的实验研究

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雷 公 藤 红 素 （ Celastrol，Solarbio 纯 度 ＞ 98% ） 以 DMSO（ Sigma 公 司 ） 助 溶 为 1 mmol / L 浓 度 保 存 于 － 20℃ 冰箱备用； CCK-8 试剂盒为武汉博士德生物工 程有Fra Baidu bibliotek公司产品； P-gp 抗体为上海晶天生物科技有限 公司产品； 阿霉素（ ADM） 为浙江海正药业有限公司产 品； 维拉帕米为上海禾丰制药有限公 司 产 品； RPMI1640 培养基为 GIBCOBRL 公司产品； 新生牛血清为杭 州四季青产品； 流式细胞仪（ FACSCalibur ） 为美国 BD 公司产品； 酶标仪（ Bio-RAD680） 。 1． 3 方法 1． 3． 1 细胞培养和实验分组 K562 细胞培养于含 10% 新生牛血清、100 U / ml 青霉素和 100 μg / ml 链霉 素的 RPMI-1640 培养液中，K562 / A02 细胞培养于含 阿霉素（ 1 μmol / L） 的上述培养基中，将 2 种细胞置于 37℃ 、5% CO2 培养箱中常规培养，2 ～ 3 天传代 1 次， 其中 K562 / A02 细胞在实验前两周改用无阿霉素的培 养基培养。取对数生长期细胞用于实验。实验分组如 下： ①K562 细胞 + ADM； ② K562 细胞 + 雷公藤红素； ③K562 / A02 细胞 + ADM； ④ K562 / A02 细胞 + 雷公藤 红素； ⑤ K562 / A02 细胞 + ADM + 雷公藤红素。 1． 3． 2 CCK-8 法检测 ADM、雷公藤红素的细胞毒性 及耐药细胞的耐 药 倍 数 取 对 数 生 长 期 的 K562 和 K562 / A02 细胞（ 2 ～ 3 × 104 cell / 孔） 于 96 孔板中，由高 到低浓度分别加入 ADM （ 160、80、40、20、10、5、2． 5、 1． 25 μmol / L） ，雷公藤红素（ 320、160、80、40、20、10、5、 2． 5 μmol / L） ，每孔设 3 个平行孔，终体积为 150 μl。 在 37℃ 、5% CO2 培 养 箱 中 培 养 72 h 后，每 孔 加 入 CCK-8 试剂 10 μl，继续培养 2 h，以空白孔调零，全自 动酶标仪于 450 nm 处测吸光度值，参比波长为 650 nm，采用 SPSS16． 0 软件计算生长抑制率 50% 时的药 物浓度即半数抑制率（ IC50 ） 。 ［2，3］ 抑制率（ % ） = （ 1 － 实验组 OD 值 / 对照 组 OD 值） × 100% ； 耐 药 倍 数 = （ 耐药细胞的 IC50 / 敏感细胞的 IC50 ） 。实验重复 3 次， 取平均值。 1． 3． 3 CCK-8 法检测雷公藤红素耐药逆转性 取对 数生长期的 K562 / A02 细胞（ 2 ～ 3 × 104 个细胞 / 孔） 于 96 孔板中。实验分组： ① K562 / A02，② K562 / A02 + 雷公藤红素，③ K562 / A02 + VLP。所加 ADM 等药 物浓度同上，每孔设 3 个平行孔，终体积为 150 μl。并 用维拉 帕 米 （ VLP） 组 5 μg / L 作 为 阳 性 对 照［4］。在 37℃ 、5% CO2 培养箱中孵育 72 h 后加入 10 μl CCK-8， 继续培养 2 h 后，以空白孔调零，检测波长同上。计算 半数抑制率（ IC50 ） 。实验重复 3 次。逆转倍数 = （ 耐
【Key words】 K562 / A02 cell line； Multidrug resistance（ MDR） ； Celastrol （ The Practical Journal of Cancer，2011，26： 226 ～ 229）
白血病是造血系统常见的恶性肿瘤，目前常用的 治疗方法是化疗，虽然化疗能使多数患者达到缓解，但 仍有大部分患者因为化疗失败而死亡。导致化疗失败 的原因有很多，其中最主要的是白血病细胞的多药耐 药（ MDR） 性的产生。这也是国内目前研究的热点。
HU Jie，ZHANG Yin，MA Bao-gen，et al． The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou，450002 【Abstract】 Objective To evaluate the effect of the celastrol on the reversal of multidrug resistance in K562 / A02 cell
公藤红素还能体外诱导非小细胞肺癌细胞株 H1299、 人急性髓系白血病细胞株 HL-60、恶性胶质细胞瘤株、 视网膜母细胞瘤等肿瘤的凋亡。最近有报道雷公藤红 素为 1 种蛋白酶体抑制剂［1］。本实验对雷公藤红素逆 转 K652 / A02 细胞多药耐药进行探讨。
1 材料与方法
1． 1 细胞株来源 人慢性粒细胞白血病红白血病急粒变耐阿霉素
K562 / A02 细胞株由山东大学齐鲁医院纪春岩教授惠 赠。人慢性粒细胞白血病红白血病急粒变 K562 细胞 株由郑州大学干细胞中心常规传代培养。 1． 2 主要仪器和试剂
实用癌症杂志 2011 年 5 月第 26 卷第 3 期 The Practical Journal of Cancer，May 2011，Vol 26，No． 3
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实用癌症杂志 2011 年 5 月第 26 卷第 3 期 The Practical Journal of Cancer，May 2011，Vol 26，No． 3
雷公藤红素逆转 K562 / A02 细胞多药耐药的实验研究
胡 婕 张 茵 马保根 翟亚萍 李玉龙 程 薇
【摘要】 目的 探讨雷公藤红素逆转人慢性粒细胞白血病红白血病急变细胞株 K562 / A02 多药耐药的效果。方法 采用 CCK-8 法测定细胞的药敏性及耐药逆转性，应用流式细胞术检测细胞内 ADM 浓度、P-gp 蛋白表达。结果 雷公藤 红素对 K562 / A02、K562 的半数抑制率浓度（ IC50 ） 分别为（ 295． 58 ± 23． 288） μmol / L、（ 411． 59 ± 26． 551） μmol / L。K562 / A02 细胞对 ADM 的耐药性是 K562 细胞的 79． 78 倍。细胞毒剂量的雷公藤红素作用后，ADM 对 K562 / A02 细胞的 IC50 显著下降（ P ＜ 0． 05） ，逆转倍数为 117． 860 倍。细胞毒剂量（ IC50 ） 和非细胞毒剂量（ IC10 ） 的雷公藤红素处理后的 K562 / A02 细胞内的 ADM 浓度显著增加（ P ＜ 0． 05） ，增加倍数分别为 1． 537 倍和 1． 102 倍。雷公藤红素能明显下调 K562 / A02 细胞的 P-gp 表达。结论 雷公藤红素对逆转 K562 / A02 细胞的耐药性有一定的作用，其机制可能与下调 P-gp 表达有 关。
药细胞逆转前的 IC50 / 耐药细胞逆转后的 IC50 ） 。 1． 3． 4 流式细胞术检测 K562 和 K562 / A02 细胞内的 ADM 浓度 取对数生长期细胞于 24 孔板中，实验分 6 组： ① K562 / A02，② K562 / A02 + ADM，③ K562 / A02 + ADM + 雷公藤红素（ IC10 ） ，④ K562 / A02 + ADM + 雷公藤红素（ IC50 ） ，⑤ K562，⑥K562 + ADM。第③、④ 组分别先加入 IC10 和 IC50 的雷公藤红素，24 h 后在第 ②③④⑥组中再加入 ADM10 μg / ml，药物作用 3 h，收 集细胞 1 × 106 个细胞，冷 PBS （ 4℃ ，0． 01 mol / L，PH 7． 4） 洗涤 2 次，再重悬于冷 PBS 液中，4℃ 保存至上样 进行流式细胞仪检测（ 激发波长 Ex = 488 nm，发射波 长 Em = 575 nm） ［5］。 1． 3． 5 流式细胞术检测 P-gp 表达 取对数生长期细 胞于 24 孔板中，实验分 4 组分别为： ①K562 / A02，② K562 / A02 + ADM （ IC50 ） ，③ K562 / A02 + 雷 公 藤 红 素 （ IC50 ） ，④ K562 / A02 + ADM （ IC50 ） + 雷 公 藤 红 素 （ IC50 ） ； 置培养箱孵育 48 h 后，收集细胞，约 3 × 105 个 细胞，用冷的 PBS 液洗 2 遍，按操作说明加入 P-gp 抗 体，室温下避光孵育 30 min 后上流式细胞仪检测，并 给出相应的 P-gp 表达率。 1． 4 统计学处理
【关键词】 K562 / A02 细胞株； 多药耐药； 雷公藤红素 中图分类号：R733． 7 文献标识码：A 文章编号：1001-5930（2011）03-0226-04
The Experimental Studies of Celastrol on the Reversal of Multidrug Resistance in K562 / A02 Cell Line
line． Methods The sensitivity of K562 and K562 / A02 to ADM and the reversal of drug resistance were determined with CCK-8 method． The concentration of intracellular ADM and P-gp expression were tested with flow cytometry （ FCM） ． Results The IC50 of celastrol to K562 / A02 and K562 cells were（ 295． 58 ± 23． 288） μmol / L、（ 411． 59 ± 26． 551） μmol / L． The resistance of K562 / A02 cells to ADM was 79． 78 times of K562 cells． After incubating with cytotoxic does of celastrol，the IC50 of ADM to K562 / A02 decreased significantly（ P ＜ 0． 05） ，and the resistance was reversed by 117． 860 times ． After incubation of cytotoxic and non-cytotoxic does of celastrol，the intracellular concentration of ADM increased 1． 537 and 1． 102 times in K562 / A02 cells（ P ＜ 0． 05） ． Celastrol could down-regulate P-gp expression obviously． Conclusion Celastrol could reverse the MDR of K562 / A02 cell line in a certain extent，which may be attributed to down-regulating of P-gp expression．
雷公藤红素（ celastrol） 是 1 种三萜类天然化合物， 又名南蛇藤素，具有免疫抑制、抑制血管内皮细胞体外 增值、抑制 HMC-1 细胞的黏附及其黏附分子表达，雷
基金项目： 河南省科技厅重点资助项目（ 编号 082300450010） 作者单位： 450002 郑州大学第一附属医院（ 胡 婕） ； 450002 河南 省人民医院血液科 （ 张 茵，马保根） ； 450002 河南省人民医院血研所 （ 翟亚萍，李玉龙，程 薇） 通讯作者： 马保根