胰岛素的分离纯化
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胰岛素的分离纯化
2005级生物技术制药 杨晨
亲和提纯ecotin-proinsulin
5 ml HiTrap HiTrap NHS-activated Sepharose HP (Amersham) coupled with 45mg trypsinogen (Sigma) 250ml periplasmic extract 4 ℃ 3–4 ml/min Wash: 100 mM Tris–HCl, pH 8.5 Elution: 50 mM HCl by FPLC（快速蛋白液相色谱法）
凝血ຫໍສະໝຸດ Baidu消化ecotin-proinsulin
0.1mg 凝血酶 室温孵化2h
分离ecotin和proinsulin
Ni–NTA chromatography NaCl、咪唑 加入到收集液调终浓度分别为300mM和5mM HisTrap FF 5 ml column 4 ℃ FPLC Wash: 50mM Tris–HCl, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0 Elution :线性梯度0-300mM咪唑 30min 1ml/min
Proinsulin (0.8 µmole per ml) trypsin (25µg per ml) carboxypeptidase B (12.5 µg per ml) at 37℃ pH 7.5 10min
Proinsulin to insulin
Bio-Gel P-30. 3M 乙酸平衡
SDS-PAGE
NuPAGE 4–12%Bis–Tris gels (Invitrogen) Buffer: 0.1 M Tris, 4.8% SDS, 16% glycerol, 0.1% Bromophenol blue and 1 M b-mercaptoethanol, pH 8.0
Proinsulin to insulin
2005级生物技术制药 杨晨
亲和提纯ecotin-proinsulin
5 ml HiTrap HiTrap NHS-activated Sepharose HP (Amersham) coupled with 45mg trypsinogen (Sigma) 250ml periplasmic extract 4 ℃ 3–4 ml/min Wash: 100 mM Tris–HCl, pH 8.5 Elution: 50 mM HCl by FPLC（快速蛋白液相色谱法）
凝血ຫໍສະໝຸດ Baidu消化ecotin-proinsulin
0.1mg 凝血酶 室温孵化2h
分离ecotin和proinsulin
Ni–NTA chromatography NaCl、咪唑 加入到收集液调终浓度分别为300mM和5mM HisTrap FF 5 ml column 4 ℃ FPLC Wash: 50mM Tris–HCl, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0 Elution :线性梯度0-300mM咪唑 30min 1ml/min
Proinsulin (0.8 µmole per ml) trypsin (25µg per ml) carboxypeptidase B (12.5 µg per ml) at 37℃ pH 7.5 10min
Proinsulin to insulin
Bio-Gel P-30. 3M 乙酸平衡
SDS-PAGE
NuPAGE 4–12%Bis–Tris gels (Invitrogen) Buffer: 0.1 M Tris, 4.8% SDS, 16% glycerol, 0.1% Bromophenol blue and 1 M b-mercaptoethanol, pH 8.0
Proinsulin to insulin