第九章:基因敲除与药学 (1)

合集下载
  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。

3. 具有一个以上的遗传标志,便于对基因重组的ES 细胞进行筛选。
常用的筛选标记为正负筛选:Neo(新霉素 磷酸转移酶)基因阳性筛选标记和HSV-tk(单 纯袍子病毒 胸腺嘧啶激酶)基因阴性筛选标记。
wenku.baidu.com
Neo新霉素基因阳性的ES细胞可以再含有G418(一种新 霉素的类似物)的培养基上生长。 HSV-tk基因阳性的ES细胞,编码的基因产物可以将更 昔洛韦等转化为有毒物质,将细胞杀死。
第九章:基因敲除与药学
基因敲除技术与诺贝尔奖
三位在基因敲除技术方面进行了卓越、开拓性工作并取得了显著成就的 科学家分享了2007年诺贝尔生理或医学奖,他们是美国盐湖城犹他州大 学的Marie Capecchi教授、美国北卡罗来纳州大学的Oliver smithies教 授以及英国加蒂夫大学的Martin Evans教授
基因敲除技术的缺陷
随着基因敲除技术的发展,早期技术中的许多不足和缺 陷都已经解决,但基因敲除技术始终存在着一个难以克 服的缺点,即敲掉一个基因并不一定就能获知该基因的 功能,
其原因包括: 一方面,许多基因在功能上是冗余的, 敲掉一个在功能 上冗余的基因,并不能造成容易识别的表型,因为基因 家族的其他成员可以提供同样的功能; 另一方面,对于某些必需基因,敲除后会造成细胞的致 死性,也就无法对这些必需基因进行相应的研究了。
基因诱捕的优点
利用基因捕获可以建立一个携带随机插入突变的ES细胞 库,节省大量筛选染色体组文库以及构建特异打靶载体的工 作及费用,更有效迅速地进行小鼠染色体组的功能分析。
基因诱捕的缺点
无法对基因进行精细的遗传修饰,
四、RNAi引起的基因敲除
①、②:双链RNA 进入细胞后,能 够在Dicer酶的作 用下被裂解成 siRNA,并在RdRP (以RNA为模板指 导RNA合成的聚合 酶RNA)的作用下 自身扩增后,再 被Dicer酶裂解成 siRNA。
将外源基因(报告基因、标记基因)的载体通过电穿 孔或逆转录病毒载体法导入ES细胞,并随机整合到细胞基 因组中,建立一个携带随机插入突变的ES细胞库。
基因诱捕所用的载体一般由报告基因、选择性标记基因 及辅助元件组成。 报告基因缺乏自身的某个表达调控序列,在捕获内源基 因的相应表达序列后获得表达。 根据所诱捕的表达调控序列的不同,广义的基因诱捕包 括: 增强子诱捕、基因诱捕、启动子诱捕、poly(A)诱捕。
。 可以分为无启动子筛选法, 无增强子筛选法, 无poly(A)筛选法。
(2)常用的筛选方法有两类
3.物理筛选方法 主要是PCR筛选方法,优点是灵敏,专一性强;。
此外还有富集或筛选率比较高时,可以用Southern blot杂交法,
(3)基因敲除的ES细胞注射入胚泡
(4)胚泡植入假孕小鼠的子宫中
二、体细胞基因敲除
伴随核移植和体细胞克隆技术的发展,体细胞基因敲除-核移植 体系为研究热点。 选择的体细胞应该有较好的繁殖能力和克隆能力。有时用带端 粒酶基因的DNA转染细胞,提高细胞的寿命和活力。
三、基因捕获
又称随机基因敲除,又称随机基因敲除,是随机插入 突变进行基因敲除的一种新型方法。
原理:
RNAi引起的基因敲除
⑤:这些新生成的siRNA也 具有诱发RNAi的作用,通 过这个聚合酶链式反应, 细胞内的siRNA大大增加, 显著增加了对基因表达的 抑制。
五、基因敲除的应用
1.基因敲除和转基因技术是研究基因的结构功能和其他生 命科学理论问题的重要工具。
2.建立生物模型。 基因敲除技术就常常用于建立某种特定基 因缺失的生 物模型,从而进行相关的研究。这些模型可以是细胞,也 可以是完整的动植物或微生物个体。最常见的是小鼠,家 兔、猪、线虫、酵母和拟南芥等的基因敲除模型也常见于 报道。
Nero基因表达,ES细胞抗新霉素,在G418的培养 基中存活。 HSV-tk基因表达,在更昔洛韦的培养基中,ES细 胞被杀死。
(2)常用的筛选方法有两类
2.正向筛选 又称标记基因的特异性表达法,仅有 正性选择性标记的标记基因,而且这种标记方法是缺乏 自身的某个表达调控序列。
标记基因因为特异整合,获得调控序列,能够表达
应用DNA同源重组原理进行基因敲除
同源重组 同源重组
插入突变 插入突变
RNAi
发生在同源序列
间的重组称为同源重
组 (homologous
recombination) , 又
称基本重组。是最基
本 的 DNA 重 组 方 式 ,
通过链的断裂和再连 接 , 在 两 个 DNA 分 子 同源序列间进行单链 或双链片段的交换。
(2)基因敲除载体导入ES细胞
将基因敲除载体导入ES细胞,以载体上的neo基因置换ES细胞基因 组的目的基因,从而得到 基因敲除细胞
基因敲除载体导入ES的方法有显微注射法,电穿孔 法,DEAG葡聚糖介导法,脂质体法,病毒感染法,精子 载体法等
(3)常用的筛选方法有两类
1.正负双向筛选系统(PNS):
3.基因敲除和转基因技术为人类疾病的基因治疗提供有力 手段。 使用基因工程技术将外源基因导入患者的病变细胞, 纠正机体基因缺陷或调节基因表达功能是细胞重新获得正 常的功能,这个过程称为基因表达。
4.基因敲除和转基因技术通过改造生物体基因,可以用于 研制优良的生物反应器,培育新的生物品种和提供异种器 官移植的供体动物。
Step 3. 将neo基因和HSV-tk 克隆到质粒中;
根据载体与靶基因组同源序列双链断裂位点位置的 不同,基因载体通常分为两种:
1.插入性载体(gene-insertion vector)
2.置换型载体(gene-replacement vector)
大多数的基因敲除中,采用的是置换性载体;而插入性 载体则更多的应用于基因敲入和对目的基因的精确突变。
基因敲除简介
定义:通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
1234567 890 123456790
同源重组 插入突变 RNAi
基因敲除(gene knock-out)
通常所说到的基因敲除,又称基因打靶,通过外源DNA 与染色体DNA之间的同源重 组,进行精确的定点修饰和 基因改造,把具有功能的同源序列置换出来,造成功能 基因的缺失或失活。
一、条件性基因敲除法:
将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某 一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。
在传统基因敲除的基础上,利用了特异性重组酶系统作为 调控的按钮,实现对基因的时刻可调节敲除。
与Cre-loxp重组酶系统有关。
条件性基因敲除优点:
① 目标基因的敲除可以限定在特定的组织、 细胞或发育的特定阶段; ② 可避免因基因突变而致死胎的问题: ③ 在2 个loxP 位点之间的重组率较高; ④ 如用病毒或配体/DNA 复合物等基因转移 系统来介导Cre 的表达,则可省去建立携带Cre的 转基因动物的过程。 常见的几种诱导性类型如下:四环素诱导型; 干扰素诱导型;激素诱导型;腺病毒介导型。
RNAi引起的基因敲除
③ :SiRNA的双链解开 变成单链,并和某 些蛋白形成复合物
RNAi引起的基因敲除
④:上述复合物同与互 补的mRNA结合,促 进mRNA被RNA酶裂解, 并且以SiRNA作为引 物,以mRNA为模板, 在RdRP作用下合成 出mRNA的互补链, 并在Dicer酶的作用 下也被裂解成siRNA。
基因敲除的必备条件
1.要有将外援基因导入宿主细胞的载体
2.能接受外援基因的受体(常用胚胎干细胞)
基因敲除载体
通常,我们将外源基因DNA片段通过相应载体导 入ES细胞中,一个好的载体应具备以下特点:
1.能在宿主细胞中稳定存在
2.具有多个限制性内切酶的单一酶切位点,即 multiple cloning site(MCS),便于外源基因 的插入。常用质粒。
胚胎干细胞(简称ES细胞)
胚胎干细胞是早期胚胎中分离出来的一类细胞,
具有体外培 养无限增殖 、自我更新 和多向分化 的特性。
基因敲除的基本程序
(1)基因敲除载体的 构建
Step1. 获得目的基因(待敲 除基因)的同源片段,将此 DNA片段克隆到一般质粒中; Step 2. 从重组质粒中切除目 的基因的大部分同源序列,只 留部分序列在线性质粒载体的 两端;
(5)嵌合体的杂交育种
导入动物胚胎后, 可以发育成嵌合子或完 全ES来源的动物。
嵌合体动物与正常的动 物杂交,子代动物再杂 交,有可能产生杂合型 突变体。
得到纯合体:
由于同源重组常常发 生在一对染色体上中 一条染色体中,所以 如果要得到稳定遗传 的纯合体基因敲除模 型,需要进行至少两 代遗传。
第三节:基因敲除 进展及前景:
相关文档
最新文档