第九章：基因敲除与药学 (1)

3. 具有一个以上的遗传标志，便于对基因重组的ES 细胞进行筛选。
常用的筛选标记为正负筛选：Neo（新霉素 磷酸转移酶）基因阳性筛选标记和HSV-tk（单 纯袍子病毒 胸腺嘧啶激酶）基因阴性筛选标记。
wenku.baidu.com
Neo新霉素基因阳性的ES细胞可以再含有G418（一种新 霉素的类似物）的培养基上生长。 HSV-tk基因阳性的ES细胞，编码的基因产物可以将更 昔洛韦等转化为有毒物质，将细胞杀死。
第九章：基因敲除与药学
基因敲除技术与诺贝尔奖
三位在基因敲除技术方面进行了卓越、开拓性工作并取得了显著成就的 科学家分享了2007年诺贝尔生理或医学奖，他们是美国盐湖城犹他州大 学的Marie Capecchi教授、美国北卡罗来纳州大学的Oliver smithies教 授以及英国加蒂夫大学的Martin Evans教授
基因敲除技术的缺陷
随着基因敲除技术的发展，早期技术中的许多不足和缺 陷都已经解决，但基因敲除技术始终存在着一个难以克 服的缺点，即敲掉一个基因并不一定就能获知该基因的 功能，
其原因包括： 一方面，许多基因在功能上是冗余的， 敲掉一个在功能 上冗余的基因，并不能造成容易识别的表型，因为基因 家族的其他成员可以提供同样的功能； 另一方面，对于某些必需基因，敲除后会造成细胞的致 死性，也就无法对这些必需基因进行相应的研究了。
基因诱捕的优点
利用基因捕获可以建立一个携带随机插入突变的ES细胞 库，节省大量筛选染色体组文库以及构建特异打靶载体的工 作及费用，更有效迅速地进行小鼠染色体组的功能分析。
基因诱捕的缺点
无法对基因进行精细的遗传修饰，
四、RNAi引起的基因敲除
①、②：双链RNA 进入细胞后，能 够在Dicer酶的作 用下被裂解成 siRNA，并在RdRP （以RNA为模板指 导RNA合成的聚合 酶RNA）的作用下 自身扩增后，再 被Dicer酶裂解成 siRNA。
将外源基因（报告基因、标记基因）的载体通过电穿 孔或逆转录病毒载体法导入ES细胞，并随机整合到细胞基 因组中，建立一个携带随机插入突变的ES细胞库。
基因诱捕所用的载体一般由报告基因、选择性标记基因 及辅助元件组成。 报告基因缺乏自身的某个表达调控序列，在捕获内源基 因的相应表达序列后获得表达。 根据所诱捕的表达调控序列的不同，广义的基因诱捕包 括： 增强子诱捕、基因诱捕、启动子诱捕、poly（A）诱捕。
。 可以分为无启动子筛选法， 无增强子筛选法， 无poly（A）筛选法。
（2）常用的筛选方法有两类
3．物理筛选方法 主要是PCR筛选方法，优点是灵敏，专一性强；。
此外还有富集或筛选率比较高时，可以用Southern blot杂交法，
（3）基因敲除的ES细胞注射入胚泡
（4）胚泡植入假孕小鼠的子宫中
二、体细胞基因敲除
伴随核移植和体细胞克隆技术的发展，体细胞基因敲除-核移植 体系为研究热点。 选择的体细胞应该有较好的繁殖能力和克隆能力。有时用带端 粒酶基因的DNA转染细胞，提高细胞的寿命和活力。
三、基因捕获
又称随机基因敲除，又称随机基因敲除，是随机插入 突变进行基因敲除的一种新型方法。
原理：
RNAi引起的基因敲除
⑤：这些新生成的siRNA也 具有诱发RNAi的作用，通 过这个聚合酶链式反应， 细胞内的siRNA大大增加， 显著增加了对基因表达的 抑制。
五、基因敲除的应用
1.基因敲除和转基因技术是研究基因的结构功能和其他生 命科学理论问题的重要工具。
2．建立生物模型。 基因敲除技术就常常用于建立某种特定基 因缺失的生 物模型，从而进行相关的研究。这些模型可以是细胞，也 可以是完整的动植物或微生物个体。最常见的是小鼠，家 兔、猪、线虫、酵母和拟南芥等的基因敲除模型也常见于 报道。
Nero基因表达，ES细胞抗新霉素，在G418的培养 基中存活。 HSV-tk基因表达，在更昔洛韦的培养基中，ES细 胞被杀死。
（2）常用的筛选方法有两类
2.正向筛选 又称标记基因的特异性表达法，仅有 正性选择性标记的标记基因，而且这种标记方法是缺乏 自身的某个表达调控序列。
标记基因因为特异整合，获得调控序列，能够表达
应用DNA同源重组原理进行基因敲除
同源重组 同源重组
插入突变 插入突变
RNAi
发生在同源序列
间的重组称为同源重
组 (homologous
recombination) ， 又
称基本重组。是最基
本 的 DNA 重 组 方 式 ，
通过链的断裂和再连 接 ， 在 两 个 DNA 分 子 同源序列间进行单链 或双链片段的交换。
（2）基因敲除载体导入ES细胞
将基因敲除载体导入ES细胞，以载体上的neo基因置换ES细胞基因 组的目的基因，从而得到 基因敲除细胞
基因敲除载体导入ES的方法有显微注射法，电穿孔 法，DEAG葡聚糖介导法，脂质体法，病毒感染法，精子 载体法等
（3）常用的筛选方法有两类
1.正负双向筛选系统（PNS）：
3.基因敲除和转基因技术为人类疾病的基因治疗提供有力 手段。 使用基因工程技术将外源基因导入患者的病变细胞， 纠正机体基因缺陷或调节基因表达功能是细胞重新获得正 常的功能，这个过程称为基因表达。
4.基因敲除和转基因技术通过改造生物体基因，可以用于 研制优良的生物反应器，培育新的生物品种和提供异种器 官移植的供体动物。
Step 3. 将neo基因和HSV-tk 克隆到质粒中；
根据载体与靶基因组同源序列双链断裂位点位置的 不同，基因载体通常分为两种：
1．插入性载体(gene-insertion vector)
2．置换型载体(gene-replacement vector)
大多数的基因敲除中，采用的是置换性载体；而插入性 载体则更多的应用于基因敲入和对目的基因的精确突变。
基因敲除简介
定义：通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
1234567 890 123456790
同源重组 插入突变 RNAi
基因敲除（gene knock-out）
通常所说到的基因敲除，又称基因打靶，通过外源DNA 与染色体DNA之间的同源重 组，进行精确的定点修饰和 基因改造，把具有功能的同源序列置换出来，造成功能 基因的缺失或失活。
一、条件性基因敲除法：
将某个基因的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某 一特定阶段的一种特殊的基因敲除方法。
在传统基因敲除的基础上，利用了特异性重组酶系统作为 调控的按钮，实现对基因的时刻可调节敲除。
与Cre-loxp重组酶系统有关。
条件性基因敲除优点：
① 目标基因的敲除可以限定在特定的组织、 细胞或发育的特定阶段； ② 可避免因基因突变而致死胎的问题： ③ 在2 个loxP 位点之间的重组率较高； ④ 如用病毒或配体／DNA 复合物等基因转移 系统来介导Cre 的表达，则可省去建立携带Cre的 转基因动物的过程。 常见的几种诱导性类型如下：四环素诱导型； 干扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介导型。
RNAi引起的基因敲除
③ ：SiRNA的双链解开 变成单链，并和某 些蛋白形成复合物
RNAi引起的基因敲除
④：上述复合物同与互 补的mRNA结合，促 进mRNA被RNA酶裂解， 并且以SiRNA作为引 物，以mRNA为模板， 在RdRP作用下合成 出mRNA的互补链， 并在Dicer酶的作用 下也被裂解成siRNA。
基因敲除的必备条件
1.要有将外援基因导入宿主细胞的载体
2.能接受外援基因的受体（常用胚胎干细胞）
基因敲除载体
通常，我们将外源基因DNA片段通过相应载体导 入ES细胞中，一个好的载体应具备以下特点：
1.能在宿主细胞中稳定存在
2.具有多个限制性内切酶的单一酶切位点，即 multiple cloning site(MCS),便于外源基因 的插入。常用质粒。
胚胎干细胞（简称ES细胞）
胚胎干细胞是早期胚胎中分离出来的一类细胞，
具有体外培 养无限增殖 、自我更新 和多向分化 的特性。
基因敲除的基本程序
（1）基因敲除载体的 构建
Step1. 获得目的基因（待敲 除基因）的同源片段，将此 DNA片段克隆到一般质粒中； Step 2. 从重组质粒中切除目 的基因的大部分同源序列，只 留部分序列在线性质粒载体的 两端；
（5）嵌合体的杂交育种
导入动物胚胎后， 可以发育成嵌合子或完 全ES来源的动物。
嵌合体动物与正常的动 物杂交，子代动物再杂 交，有可能产生杂合型 突变体。
得到纯合体：
由于同源重组常常发 生在一对染色体上中 一条染色体中,所以 如果要得到稳定遗传 的纯合体基因敲除模 型，需要进行至少两 代遗传。
第三节：基因敲除 进展及前景：