家蝇Defensin基因原核表达条件的优化及其抑菌活性

１ ／ Ｄ ｅ ｆ ｅ ｎ ｓ ｉ ｎ的 Ｂ Ｉ ２ １ （ Ｄ Ｅ ） 单菌 落进行 培养 ， 检测 目的 基 因在不 同条件 的表 达水平 。（ １ ） 菌液 的起 始浓度 不
同（ ０ Ｄ 为 ０ ． ４ 、 ０ ． ６ 、 ０ ． ８ 、 １ ． ０ ） 。（ ２ ） Ｉ ｌ Ｙ Ｆ Ｇ的 诱 导 终 浓
１ 材 料 与 方 法
１ ． １ 材 料
菌Ｂ Ｌ ２ １ （ Ｄ Ｅ ） ， 筛选 阳性表达菌 。 １ ． ２ ． ３ ｐ Ｇ Ｅ Ｘ一 ４ Ｔ一 １ ／ Ｄ ｅ ｆ ｅ ｎ ｓ ｉ ｎ重组质粒表达条件 的优化
参照文献［ ４ ］ 的方法 ， 挑取含有重组质粒 ｐ Ｇ Ｅ Ｘ一 ４ Ｔ一
切产物再 与 经 Ｂ ａ ｍ Ｈ Ｉ和 Ｘ ｈ ｏ Ｉ 酶切后的 ｐ Ｇ Ｅ Ｘ一 ４ Ｔ一１ 原核表达载体 连接 ， 构建重组质粒 ｐ Ｇ Ｅ Ｘ一 ４ Ｔ一 １ ／ Ｄ ｅ ｆ ｅ ｎ ｓ ｉ ｎ 。此重组 质粒 经测序 正确后 转 化大肠 埃 希
的基础上 ， 将 家蝇幼 虫 Ｄ ｅ ｆ ｅ ｎ ｓ ｉ ｎ基 因克 隆入 原核 表 达载体 ， 对其表达条件进行优化 ， 并对表达产物进 行抑 菌活性 的研究 。
鉴定 目的蛋白的表达情 况和 分子量 。用凝 血酶切除谷 胱甘肽标 签 ， 并通过体 外抑茵 实验检 测其抗 茵活性 。结果 成功构建重组质粒 ｐ Ｇ Ｅ Ｘ一 ４ Ｔ一１ ／ Ｄ ｅ ｆ ｅ ｎ ｓ ｉ ｎ ， 目的基 因能够在 大肠 埃希 菌 内高效表达 ， 分子 量为 ４ ｋ Ｄ， 与预期值
１ ． １ ． １ 受体 菌 与 载 体 大 肠 埃 希 菌 Ｄ Ｈ ５ ｃ ￣ 、 Ｂ Ｌ ２ １
（ Ｄ Ｅ 。 ） 和ｐ Ｕ Ｃ ｍ —Ｔ ／ Ｄ ｅ ｆ ｅ ｎ ｓ ｉ ｎ重 组质 粒 为广 东 省生 物
活性药物研究重点实验室保存 ， 原核表达载体 ｐ Ｇ Ｅ Ｘ一
４ Ｔ一１ 购 自Ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ ｇ ｅ ｎ 公 司。 １ ． １ ． ２ 主要试 剂 本实验所 用分子 生物学相关 试剂 均购 自Ｔ ａ Ｋ ａ Ｒ ａ公 司； Ｐ Ｖ Ｄ Ｆ膜、 蛋 白质 标 准分 子质 量 为华美生物公 司 产 品； 丙 烯 酰胺 、 Ｎ ， Ｎ 一亚 甲叉 双丙
有望开发成一类新型 的多肽抗生 素
。 由于其在组
织 中含量低 ， 分离获得大量 的天然产物很 困难 ， 而人工
合成多肽的成本高 ， 限制 了其应用前景 。因此 ， 利用基
Ｘ ｈ ｏ Ｉ 酶切位点 ） ， 拟扩增家蝇 幼虫 Ｄ ｅ ｆ ｅ ｎ ｓ ｉ ｎ基 因的编 码序列 。引物由北京三博合成 。
昆虫防御素（ Ｄ ｅ ｆ ｅ ｎ ｓ ｉ ｎ ） 是一类碱性小分子多肽 ， 具 有热稳定性强 、 诱导 源的非专一性和抗菌谱广等 特点 ，
弓 Ｉ 物Ｐ ｍ ｌ （ ５ 一 ｃ ｇ ｃ ｇ ｇ ａ ｔ ｃ ｃ ｇ ｃ ｔ ａ ｃ ｔ ｔ ｇ ｃ ｇ ａ ｔ ｔ ｔ ｇ ｔ 一 ３ ， 含Ｂ ａ ｍ Ｈ Ｉ 酶切位点 ） 和Ｐ ｍ ２ （ ５ 一ｃ ｇ ｃ ｔ ｃ ｇ ａ ｇ ａ ｃ ａ ｃ ｃ ｔ ｃ ａ ｇ ｔ ｔ ａ ｃ ｇ ｇ ｃ 一 ３ ， 含
许 琴 英 ，朱 家勇 ， 金 小宝。 ， 徐 建华
。 广东 医学院寄 生虫学 暨临床寄 生虫检验 学教研 室（ 广 东 湛江 ５ ２ ４ ０ ２ ３ ） ； 广 东省 生物活 性药物研 究重 点实验 室 （ 广州 ５ １ ０ ０ ０ ６ ）
【 摘要 】 目的 优化 家蝇 Ｄ ｅ ｆ ｅ ｎ ｓ ｉ ｎ 基 因原核表达条件 ， 并初步研究其抑菌活性。方法
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２ ４ ５ ８・
广 东医学
２ ０ １ ３年 ８月 第 ３ ４卷第 １ ６期
Ｇｕ ａ ｎ ｇ ｄ ｏ ｎ ｇ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ Ａｕ ｇ ．２ ０ １ ３ ． Ｖｏ １ ．３ ４． Ｎ ｏ ．１ ６
家蝇 Ｄ ｅ ｆ ｅ ｎ ｓ ｉ ｎ基 因原 核 表达 条 件 的优 化 及 其 抑 菌 活 性
蝇幼 虫 Ｄ ｅ ｆ ｅ ｎ ｓ ｉ ｎ基 因 的重 组 质 粒 ｐ Ｕ Ｃ ｍ —Ｔ ／ Ｄ ｅ ｆ ｅ ｎ ｓ ｉ ｎ
物进行 Ｐ Ｃ Ｒ， 扩增家蝇幼虫 Ｄ ｅ ｆ ｅ ｎ ｓ ｉ ｎ基因的序列 ； 扩增 产物纯化后 以 Ｂ ａ ｍ Ｈ Ｉ 和 Ｘ ｈ ｏ Ｉ 对其进行 酶切 ； 此酶
１ ． ２ ． ２ 家蝇 Ｄ ｅ ｆ ｅ ｎ ｓ ｉ ｎ基 因原 核 表 达 质 粒构 建 以 ｐ Ｕ Ｃ ｍ— Ｔ ／ Ｄ ｅ ｆ ｅ ｎ ｓ ｉ ｎ重组质粒为模板 ， 以Ｐ ｍ ｌ 、 Ｐ ｍ ２ 为引
因重组技术克隆表达基 因是获取昆虫抗菌肽 的理想途 径 。大肠埃希菌表达 系统是最常用 的基 因工程表 达系 统， 研究者 已利用 该系 统表达 了多种 蛋 白。２ ０ ０ ５年 １ 月至 ２ ０ ０ ７年 １ ２月 ， 本 研究在 实验 室 已构 建 的含有家
一
ห้องสมุดไป่ตู้
致， 表达量约达 ４ ０ ％ 。抑茵 实验显 示其 对大肠 埃希 茵 Ｋ Ｄ 生长 有一 定的抑 制作 用。结论 本 实验 为 家蝇
Ｄ ｅ ｆ ｅ ｎ ｓ ｉ ｎ基 因功 能 的 深入 研 究 奠 定 了工作 基 础 。
【 关键词 】 抗 茵肽 ； 表达； 活性 ； Ｄ ｅ ｆ ｅ ｎ ｓ ｉ ｎ
Ｄ ｅ ｆ ｅ ｎ ｓ ｉ ｎ 基 因成熟肽
被克隆入 ｐ Ｇ Ｅ Ｘ一 ４ Ｔ一１ 原核表 达载体 中， 构建 重组质粒 ｐ Ｇ Ｅ Ｘ一４ Ｔ一１ ／ Ｄ ｅ ｆ ｅ ｎ ｓ ｉ ｎ ， 并转化宿 主菌后诱 导表 达 ， 表达
过 程 中对 茵 液起 始 浓度 、 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 浓度 、 诱 导 温 度 和 时 间进 行 优 化 。采 用 亲 和 层 析 法分 离 纯 化 融 合 蛋 白 ． Ｓ Ｄ Ｓ—Ｐ Ａ Ｇ Ｅ