秦皮实验

秦皮中香豆素类成分的提取与分离秦皮为木樨科苦枥白蜡树Fraxinus rhynchophylla、白蜡树Fraxinus chinensis、尖叶白蜡树Fraxinus szaboana、宿柱白蜡树Fraxinus stylosa的干燥枝皮或干皮。

功能清热燥湿善治湿热泄泻及痢疾对湿热痹症亦有清湿热、宣痹止痛之效。

现代研究证明秦皮具有抗炎镇痛和降低血尿酸的作用，用于治疗痛风疗效甚佳，其有效成分为秦皮甲素（Esculin）、秦皮乙素（Esculetin）等香豆素类成分。

一、已知成分物理性质
1.秦皮甲素（Esculin，又名七叶苷）：
白色针状结晶，熔点:204℃-206℃,溶于甲醇，乙醇和乙酸，可溶于沸水。

也易溶于稀碱液，并显蓝色荧光。

2.秦皮乙素（Esculetin，又名七叶内酯）：
淡黄色针状晶体(稀醇)或黄色叶状结晶(真空升华)，熔点：271-273°C，易溶于甲醇,乙醇和冰醋酸，可溶于丙酮，不溶于乙醚
和水。

也易溶于稀碱液，并显蓝色荧光。

二、实验目的
1、掌握香豆素与木质素的结构特点与理化性质。

2、掌握蒸馏法、萃取法和结晶法的操作方法及注意事项。

3、熟悉荧光实验与异羟肟酸铁实验鉴别七叶苷与七叶内酯的原理。

4、熟悉薄层色谱的操作流程。

三、实验原理
七叶苷、七叶内酯均能溶于沸乙醇，可用沸乙醇将二者提取出来，用氯仿洗涤去除脂溶性杂质，再利用二者在乙酸乙酯中的溶解性不同而分离之。

四、实验流程
五、实验方法
1.乙醇总提取物的制备
方法一：取秦皮粗粉150g，用95%乙醇回流提取三次（500ml回流1h ,200ml回流两次，每次1h）。

合并乙醇液，抽滤，减压回收乙醇至浸膏状（乙醇回收至无醇味）。

方法二：取秦皮粗粉150g于索氏提取器中，加400ml乙醇回流10-12小时，得乙醇提取液，减压回收溶剂至浸膏状，即得总提取物。

2、香豆素成分的分离
（一）七叶内酯的分离与纯化
在上述浸膏中加40ml水加热溶之。

移于分液漏斗中，以等体积氯仿萃取二次，将氯仿萃取过的水层蒸去残留氯仿后加等积乙酸乙酯萃取二次，合并乙酸乙酯液，以无水硫酸钠脱水，减压回收溶剂至干。

残留物用温热甲醇溶解，浓缩至适量，放置析晶，有黄色针状结晶析出，过滤出结晶。

甲醇-水反复重结晶，即得七叶内酯精品。

（二）七叶苷的分离纯化
将乙酸乙酯萃取过的水层浓缩至适量，放置析晶，有微黄色晶体析出，过滤出结晶。

以甲醇-水反复重结晶，即得七叶苷精品。

4、鉴识
（1）化学检识
取七叶苷、七叶内酯各少许分别置试管中，加乙醇1ml溶解。

加1%FeCl3溶液2-3滴，显暗绿色，再滴加浓氨水3滴，加水6ml，日光下观察显深红色。

（2）薄层鉴定
吸附剂：硅胶TLC
样品：七叶苷、七叶内酯标准品及七叶苷﹑七叶内酯的样品液
展开剂：环己：烷丙酮（1:2）
显色：1）UV254灯下观察，七叶苷为灰色荧光，七叶内酯为灰褐色。

2）以重氮化对硝基苯胺喷雾显色，七叶苷和七叶内酯均呈玛瑙色。

（3）显色反应
取样品少许，用乙醇溶解，做如下反应
（1）荧光反应：将试液滴在滤纸上，在紫外光（365nm）观察荧光。

（2）异羟肟酸铁反应
取试液1ml，加等体积1%HCl，然后滴入三氯化铁2-3滴，观察颜色。

（3）酚羟基反应
取试液1ml，加2-3滴三氯化铁，观察颜色。

取样品少许，用乙醇溶解，做如下反应
（4）荧光反应：将试液滴在滤纸上，在紫外光（365nm）观察荧光。

（5）异羟肟酸铁反应
取试液1ml，加等体积1%HCl，然后滴入三氯化铁2-3滴，观察颜色。

（6）酚羟基反应
取试液1ml，加2-3滴三氯化铁，观察颜色。

（7）Gibbs反应
取试液1ml，滴加0.5%2,6-二氯苯醌氯亚胺的乙醇溶液2-3滴，并加Na2CO3调PH10左右，观察颜色。

（8）Emerson反应
取试液1ml，滴加4-氨基安替比林和铁氰化钾试液2-3滴，并加Na2CO3调PH10左右，观察颜色。

六、思考题
1、香豆素类化合物有哪些理化性质？
2、简述薄层色谱中展开剂的PH对弱酸性香豆素Rf的影响。

3、通过提取分离秦皮中的七叶内酯和七叶苷，简述两项溶剂萃取法的原理是什么？操作是要注意什么，若萃取过程中发生乳化应如何处理?
七、参考文献
[1] 张琦, 张新申, 代勇 . 正交试验法优选秦皮香豆素醇提工艺[J] . 林业化学与工业,2009, 29 (3): 89-92.
[2] 熊利芝, 马青, 龙华 . 秦皮总香豆素超声辅助提取工艺优化[J] . 中药材,2012, 35 (4): 634-637.
[3] 魏秀丽, 杨春华, 梁敬钰 . 中药秦皮的化学成分 [J] . 中国天然药物,2005, 3(4): 228-230.。