实验二：淋巴细胞分离实验

实验步骤



1、准备计数板： 2、制备细胞悬液：收集细胞，制成单个细胞 悬液 3、加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许 细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细 胞悬液， 4、计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数 板四角大方格中的细胞数
Leabharlann Baidu验步骤

5、计算：将结果代入下式，得出细胞密度 细胞数/毫升原液 =（4大格细胞数之和/4）×104
实验步骤


1.实验一获取的小鼠脾脏载玻片研磨 （研磨同时滴加1640培养液，保持细 胞活性） 2. 细胞混合液静置数分钟后吸管吸取， 沿倾斜的管壁缓缓加入淋巴细胞分层 液上方（Ficoll：血细胞=1：1）
实验步骤

3.2000r/min，离心15min

4.沿管壁周缘轻轻吸取淋巴细胞层移 入另一试管中
原理
红细胞
1.093 1.092
淋巴细胞 单核细胞
外周血
粒细胞
单个核细胞 (PBMC) 血小板
1.075~1.090 1.030~1.035
Ficoll：1.077±0.001
稀 释 外 周 血
稀释的血浆、 血小板
1500rpm, 20℃ , 30min
PBMC
Ficoll
Ficoll
红细胞 粒细胞
实验二
小鼠脾脏淋巴细胞的分离
小鼠脾脏淋巴细胞的分离

目的 原理 实验步骤 注意事项
目的

熟悉淋巴细胞和外周血单个核细胞 （PBMC）的分离方法
原理

脾脏各种血细胞的密度不尽相同， 利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作 密度梯度离心，使一定比重的细胞 群按相应密度梯度分布，从而将各 种血细胞加以分离。
实验步骤


5.加足量稀释液充分洗涤，1000 r/min 离心5min ，弃上清 6. 适量的培养基重悬细胞 ，计数
注意事项


1.在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢 加，以免冲散界面 2. 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过 多的上清液或分层液而导致血小板污染
细胞计数
实验步骤 注意事项
注意事项



1.取样计数前，应充分混匀细胞悬液 2.加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带 气泡 3.细胞压中线时，数上不数下，数左不数右 4.本法要求细胞密度不低于104细胞/ml 5.镜下计数时，细胞数过少或过多，说明稀 释不当，需重新制备细胞悬液、计数
试验报告要求



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