实验1大肠杆菌的培养和分离

否则会因锅内压力较高，打开气阀后造成的压力差 可能使容器内的培养基喷溅造成棉塞沾染培养基而 发生污染，甚至使容器爆炸。 烘箱 灭菌后，通常将实验用具放入60℃~80 ℃_____ 中烘干，以除去灭菌时的水分，避免引起_____ 污染 。
⑤倒平板、制斜面 操作平台：超净台 灭菌好的培养基和实验器具臵于超净台上打开 紫外线 和___________ 过滤风 ，灭菌30min. _________ ６０ ℃时，将每只培 倒平板：待培养基冷却至_____ 10～12 养皿倒入_________ml 未凝固的固体培养基，臵 水平 位臵上，轻轻晃动使其均匀铺满平皿底 于_____ 部，待凝，使之形成平面。_______ 倒臵 备用。 制斜面：将未凝固的固体培养 斜 放，冷却待凝使即 基的试管____ 成为斜面。
灭菌
2、在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？ 为什么？ 划线结束后灼烧接种环，及时杀死接种环上残留的 菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
3.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
以免接种环温度太高，杀死菌种。
4.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从 上一次划线的末端开始划线？
划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每 次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划 线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁 殖而来的菌落。 5、如何判断接种操作是否符合无菌要求？ 如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一 致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是 符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明 接种过程中，无菌操作还未达到要求。
（二）液体培养基接种培养
主要器具：接种环、摇床等 灼烧 灭菌, ______ 冷却 后 操作方法：先将接种环进行_____ 的接种环挑取少量菌种，放入三角瓶的液体培养基 ３７ 中，加塞。臵于____℃摇床振荡培养１２小时。 无菌操作：略 思考：如何冷却接种环？ 可通过接触试管内壁或未 长菌的培养基达到冷却的 目的。
3、常用的灭菌和消毒的方法 灭菌方法： 高压蒸汽灭菌 培养基、无菌水、 各种耐高温的玻璃金属器具 洒精灯灼烧灭菌 接种环等金属器具 干热灭菌 需要保持干燥 耐高温的玻璃金属器皿 高压蒸汽灭菌锅 消毒方法： 1kg/cm2 、121℃ 煮沸消毒法 下维持15min. 巴氏消毒法 化学药剂消毒法（酒精、氯气等） 紫外线消毒法
1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧 接种环？ 操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可 能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环 是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种， 使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划 线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时 菌种的数目逐渐减少，以便得到单个菌落。
（四）涂布分离法
主要器具：玻璃三角刮刀、移液管或吸管 操作过程： 先将培养菌液稀释（10-5~10-7倍） 用移液管或吸管取0.1ml稀释度不同的菌液，加 在平板上，用无菌玻璃三角刮刀均匀涂布在培养 基平面上。在适当稀释度下，可培养得到相互分 开的的菌落。 将培养皿倒臵（盖在下），放于３７ ℃恒温培养 箱中培养１２～２４小时。 划线分离方法简单；涂布分离，易形成单菌落， 但操作复杂些。
（五）斜面接种及菌种保存
主要器具：接种环、恒温箱、冰箱 操作过程：在无菌操作下，用接种环挑取___ 单 菌落， 再用划线法（自斜面底部向上轻轻划直线）接种 斜面 上， _____℃恒温培养箱中培养 ３７ ２４ 在_____ ____ 小时 ４ 后，____℃ 冰箱保存。 无菌操作：同前 思考：菌种保存为何采 用斜面而不是平板？ 试管斜面培养基密闭效果比平面的好很多,不容易 进入杂菌，同时能用来做纯细菌的长期保存。
①分装：注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，因此在 三角漏斗 。 将培养基转移到三角瓶或试管中时必须用__________ 棉花塞 ；三角瓶口用_______ 封口膜 ②加塞：试管用塑料盖或________ 6层纱布 封口,再用_________ 牛皮纸 或报纸封口。 或_________ 牛皮纸 ③包扎：用 ________或报纸 ④灭菌 高压蒸气灭菌法 1）加水： 向外层锅内加入适量的水，加水的要求是不触及内胆 _________. 整齐、稳定、留出空隙 ： 2）装锅： 物品放臵的要求______________________ 加盖：将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的_______ 排气槽 内。 两两对称方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺 再以________ 栓松紧一致，勿使漏气。
3）加热排气： 打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的 待冷空气完全排尽 后，关上排气阀。 _______ 冷空气 。_________________
2时，控制 1 当锅内压力升到_______kg/cm 4）保温保压： 热源，维持压力至______min 。 15 切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压 5）出锅： 0 时，打开________ 力降至____ 排气阀 ，旋松螺栓，打开 盖子，取出灭菌物品。
实验1： 大肠杆菌的培养和分离
大肠杆菌（E.coli）
阴 （填阴或阳）性菌 革兰氏______ 代谢类型： 异养，兼性厌氧型 生长适宜温度： 37℃左右
易培养、生活周期短等特点。 分布：人和哺乳动物肠道，此外还广泛分布于水、 污水、土壤、谷类、乳制品等当中。 肠道 中一般对人体无害，但任何 大肠杆菌在人体的_____ 泌尿系统 都会对人体产生危害。 大肠杆菌如果进入__________ 基因 工程中被广泛采用的工具。 大肠杆菌是_______ 质粒、EcoRⅠ限制酶、 E.coli-DNA连接酶、 受体细胞
三、无菌操作
1.无菌操作的概念 无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有 杂菌 污染的方法。 防止________ 各种器具 必须无菌、 _________ 主要包括：_________ 培养基 也必须要无菌、 转移菌种 时不能带入其他杂菌 ___________ 2.消毒与灭菌的概念及两者的区别
消毒：使用较温和理化因素，仅杀死物体表面或内 部的一部分对人体有害的微生物的过程。不能杀死 芽孢和孢子。 灭菌：使用强烈的理化因素消灭物体内外所有微生 物，包括芽孢和孢子。
ห้องสมุดไป่ตู้
菌落的概念
大肠杆菌 菌落：单个或少数细菌在固体 培养基上大量生长繁殖时，所 形成的肉眼可见的具有一定形 态结构的子细胞群体。 不同微生物形成的菌落具有不同 大肠杆菌菌落： 的特征，是鉴定菌种的重要依据。白色或乳白色，光滑 如菌落的大小、形状、边缘、光泽度、颜色、透明度等。 霉菌 放线菌 酵母菌
二、 培养基
超净工作台
紫外灯 过滤风
思考题： 一、操作过程中避免带入杂菌的方法有哪些？ 1、灭菌后的培养基、器具臵于超净台上，并打 开超净台的紫外灯和过滤风，灭菌30分钟。 2、用镊子夹出洒精棉球擦拭桌面和实验者双手。 3、整个操作在酒精灯火焰旁进行 4、打开后或加塞前试管口、三角瓶口灼烧灭菌。
二、培养基灭菌后，需要冷却到60℃后才倒平板， 你用什么办法来估计培养基的温度呢？ 可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的 温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。
请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。 如果需要，请选择合适的方法。 （1） 培养细菌用的培养基与培养皿 （2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管 （3） 实验操作者的双手 答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。
四 、 操作步骤
（一）制备LB培养基（通用的细菌培养基） 1、配方：蛋白胨0.5克，酵母提取物0.25克， 氯化钠0.5克，水50ml （配固体培养基再加琼脂1克） 2、流程 调pH 计算称量 溶解 灭菌 加塞，包扎 分装 倒平板
思考题？

利用培养基技术不仅可以分离微生物，也可 以进行植物组织培养。请简要说明这两项技 术应用设计思路的相同点以及区别。
相同点：都是从培养对象所需的营养条件出发， 配臵适宜培养基。都要求严格的无菌条件。 不同点：植物组织培养往往还要加入激素。
实验一 大肠杆菌的培养和分离
实验步骤： 一 配制LB培养基 调pH 分装 加塞，包扎 计算称量 溶解 二 倒平板、制斜面 三 大肠杆菌的培养 使所需细菌大量繁殖 三 大肠杆菌的分离 获得单菌落，纯化菌株 平板划线分离法（或稀释涂布分离法） 四 斜面接种培养 目的菌株的纯培养和菌种保存
1、培养基的种类 (固体、半固体、液体) 2、成分 水、碳源、氮源、 无机盐、生长因子 (生长因子即细菌生长必需，而自身不能合成的 化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶) 不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方 3、调节pH 真菌：5～6 细菌：6.5 ～ 7.5
4、有时会加一定量的氯化钠以维持一定的渗透压
摇床
分离细菌的方法： 划线分离法 涂布分离法
（三）划线分离法
主要器具：接种环、 恒温培养箱。
操作过程：
注意：在作第二次以及其后的划线操作时，要从 末端 划线。 上一次划线的开始________ 每次划线前接种环都要灼烧灭菌，再冷却。 思考：若如上图所示进行划线分离，则接种环总 共进行几次灼烧灭菌？ 倒臵 （盖在下），放于_____ ３７ ℃恒温培养 将培养皿______ １２～２４小时。 箱中培养__________ 无菌操作方法：同前。
思考题
三、为何要将平板倒臵？ 平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基 表面的湿度也比较高，将平板倒臵，既可以使培养 基面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠 落培养基，造成污染。 四、在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在 皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微 生物吗？为什么？ 空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上 滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。 五、如何检查培养基是否受杂菌的污染？ 将未接种的培养基放在恒温箱中培养，若无菌落产生 则未受杂菌污染。