Bru细胞增殖检测实验

B r d u检测细胞增殖实验实验操作:

1．铺细胞，每个3.5cm dish 10万个，在37℃、5%CO2孵箱中培养72h（细胞密度至50-60%左右）。

2．Brdu（5-溴-2′-脱氧尿苷）加入培养细胞中，1mg/ml，标记48h。(量：Brdu以铺满整个dish底面为准。)

3．固定：PBS洗细胞爬片3次，每次5min，在摇床上晃动清洗，4%PFA固定30min。

）

试剂配制：

a. Brdu的溶解：室温下，将250mg粉末溶于2.5ml的DMSO中，储存浓度为100mg/ml分

装，每管120ul，-20℃保存。

b. 2 mol/L HCl：取8.333mL 12 mol/L HCl的浓HCl，加入DDW定容至50 mL。

c. 0.1 mol/L硼酸钠：称量1.907g硼砂（Na2B4·10H2O 381.36 g/mol），加入DDW定容至50

mL，调PH=8.3。

d. 0.2% Triton X-100：有0.5%的Triton-100（2.5 mL原液溶解于47.5 mL的PBS中），用

PBS稀释至0.2%。

e. 3% BSA：称量1.5g BSA，溶解于50 mL的PBS中。

f. 1% BSA：用PBS稀释3%BSA至1%。

g. 4%FPS：4%多聚甲醛。

我是用DDW配制的，后来我发现很难溶，磁力搅拌器加热搅拌，虽然温度控制在60℃以下，也总是担心多聚甲醛分解为甲醛，所以，我就总结为如下：提前配制。

4%多聚甲醛溶液（pH7.2）试剂：多聚甲醛（PFA） 4g DDW 至100ml

配制方法：称取4g多聚甲醛（粉末状），置于三角烧瓶中，加入80mlDDW，放入37恒温水浴箱，每隔1-2小时摇晃混匀，16-24小时PFA会完全溶解。补充DDW，调节PH值。

实验原理：

1.免疫染色实验的基本原理

利用固定剂（通常是甲醛或多聚甲醛）将细胞固定，使得细胞膜的通透性大大增加，并

DAPI为4’，6二脒基-2-苯吲哚(4’，6—diamidino-2—phenylindole)，能与双链DNA 小槽，特别是AT碱基结合，也可插入少于3个连续AT碱基对的DNA序列中。当它与双链DNA结合时，荧光强度增强20倍，而与单链DNA结合则无荧光增强现象，因此是一种简易、快速和敏感地检测DNA的方法。DAPI的荧光强度虽较Hoechst低，但荧光稳定性优于Hoechst；其特异性较溴化乙啶(ethidlium bromide，EB)和碘化丙啶(propidium iodide，P1)高。DAPI的中文名称是4，6-联脒-2-苯基吲哚，是一种常用的荧光染料，其作用机理与溴化乙锭（EB）等染色剂的机理类似：它们与DNA双螺旋的凹槽部分可以发生相互作用，从而与DNA的双链紧密结合。结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，正

好UV（紫外光）的激发波长是356nm，使得DAPI成为了一种常用的荧光检测信号。

ANAL YSIS OF CELL CYCLE

1. INTRODUCTION

Cell cycle and apoptosis are very important functional parameters to assess the cellular metabolism, physiology and pathology. Several techniques have been developed to quantitate these parameters utilizing the differential staining of fluorescent dyes. We are describing four different flow cytometric methods, two for the discrimination of cell cycle phases (A and B) and two for the simultaneous assessment of cell cycle and apoptosis (C and D).

A) Bromodeoxyuridine/Propidium Iodide

The classical method for the analysis of cell cycle distribution is the flow cytometric measurement of DNA content which can simultaneously determine the incorporation of

a

the

to

and

of fluorescein-labeled nucleotides to DNA strands breaks in situ . DNA content is revealed by red fluorescence from PI. In order to have more details, see the Chapters related to TUNEL technique.

D) F-Actin/Propidium Iodide

The analysis of apoptotic cells and estimation of their cell cycle specificity is also possible using a recent method. This is based on identification of apoptotic cells which have modified their cytoskleton and their DNA content. In specific, paraformaldehyde (PFA) fixation followed by staining of F-actin with fluorescein-conjugated phalloidin and of DNA with PI, are used. Furthermore, this procedure may be utilized also for adherent cells.

A) BrdU/PI PROTOCOL