牛分支杆菌广西分离株Hsp 65基因的克隆及序列分析

１ １ １ 菌种和 载体 ． ．
牛分支 杆菌 Ｃ ８ Ｏ １ 活菌 、 ６０ ０ 灭
ห้องสมุดไป่ตู้
牛分 支杆 菌 Ｂ Ｇ 抗原购 自中国兽 医 药 品监 察 所 ； Ｃ 牛 分支 杆菌分 离株 ｍｔ５ 、 ３ ０由本 室分 离 并保 存 ； ３ ９ ｍｔ７
载体 ｐ ＭＤ１一 ８Ｔ为宝 生生 物 工 程 （ 连 ） 限 公 司产 大 有
中 图分 类 号 ： ８ ２ ６ ８ ￥ ５ ． １ 文 献 标 识码 ： Ａ 文章 编 号 ： ０ ７５ ３ （ ０ ０ １ — ０ ００ １０ —０ ８ ２ １ ）１０ １—５
牛结 核 病 （ ｏ ｉｅｔ ｂ ｒｕｏ ｉ） Ｂ ｖｎ ｕ ｅｃ ｌｓｓ 主要 是 由 牛 分 支杆 菌 （ ｃｂ ｃｅｉｍ ｂ ｒｓ Ｍｙ ｏ ａ ｔｒｕ ｏ ｉ）引 起 的 一 种人 兽 共
动物 医学进展 ，０ ０ ３ （ Ｉ ：０ １ ２ １ ， ｌ １ ） １— ４
Ｐｒ ｇ ｅ ｓ ｉ ｅ ｅ ｉ ｒ ｅ ｉｉ ｏ ｒ ｓ ｎ Ｖ ｔ ｒｎａ ｙ Ｍ ｄ ｃｎｅ
牛 分 支杆 菌广 西分 离株 Ｈｓ 因的克 隆及 序 列分 析 ｐ６ ５基
谢 志 勤 谢 芝 勋¨ ， ， 刘加 波 庞耀 珊 邓 显 文 谢 丽基 温 ， ， ， ， 娟 张 振 荣。 黄 海 强。 ， ，
制品而 感 染 。２ ０ ０ ２年 全 世 界 结 核 病 患 者 超 过 ７ ０ ０ 万 ， ３ ０ 人死 于结 核病 ， 中包括 １ 近 ０万 其 Ｏ万名 儿 童 。 据 ＷＨＯ 报 告 ， 球 被 结 核 分 支 杆 菌 感 染 者 约 ２ 全 ０
亿 ， 核病人 约 ２０ ０万 ， 结 ０ 每年 至 少 有 ３０ ０万人 感 ０ 染结 核分支杆 菌 ， 新增 结核病 患 者 ８ ０万 人 ， 年 死 ０ 每
菌菌株的 Ｈｓ ５基 因差异 不 大 ， 明牛分 支杆 茵分 泌蛋 白 Ｈｓ ５基 因 十分保 守 ， 而 为检 测 跟踪 菌株 的 ｐ６ 说 ｐ６ 从
变异 ， 制牛 分支 杆 菌亚单位基 因疫苗奠 定基础 。 研 关键 词 ： 牛分 支杆 菌 ； ｐ６ Ｈｓ ５基 因； 合酶链 反应 ； 列分析 聚 序
一
白酶 Ｋ 为 Ｍｅｋ ｒ 司产 品 ； ｒｅ 公 十二烷 基磺 酸钠 （ Ｄ ） Ｓ Ｓ 为 Ｐ ｏ ｇ 公 司产 品 ； 回收 纯 化试 剂 盒 为北 京 博 ｒｍｅ ａ 胶 大公司产 品 ， 其他 试剂 均为进 口或 国产 分析 纯 。
１ ２ 方 法 ．
，
也是牛分 支杆 菌分 泌物 的一 种蛋 白， 它定位 在 分
热休克蛋 白（ ｏ ｈ ｃ ｒｔｉ ，Ｈｓ ） ｈ ｔｓｏ ｋｐ ｏｅ ｎ ｐ 广泛 存在
于生 物界 中， 一个 重 要 特 点是 他 们 在 进 化过 程 中 的
高 度保守性 ， 明它们 具 有 普 遍 存 在 的重 要 生 理 功 说 能， 而热休 克蛋 白 ６ （ ｐ６ ） 热休 克蛋 白家 族 之 ５ Ｈｓ ５ 是
物经纯化后 与栽 体 ｐ ＭＤ １ －８连接 ， 然后 转 染大 肠埃 希 茵 ＤＨ５ 。提取 转 染后 大肠埃 希 茵的质 粒 进行 双酶 切 ａ 和 Ｐ Ｒ鉴 定 ， 定为 阳性 的质粒进 行序 列测 定。测序 后通 过序 列分析 软 件 Ｄ ｔｒＭｅ Ａｌ ｎ对 Ｈｓ ５ Ｃ 鉴 ＮＡ Ｓ ａ ｇ ｉ ｇ ｐ ６
（． 西 兽 医研 究 所 ， 西 南 宁 ５ ０ ０ ；． 西 南 宁 市 动 物疫 病 预 防诊 断 中 心 ， 西 南 宁 ５０ ０ ； １广 广 ３０１２广 广 ３ ０ １
３广西武宣动物疫病预防诊断中心 ， 西武宣 ５５０） ． 广 ４ ９ ０
摘 要 ： 用牛 分 支杆 菌 Ｈｓ ５基 因特异 性 引物 ， ２株牛 分 支杆 菌广 西分 离菌株进 行 Ｐ Ｒ 扩增 ， 利 ｐ６ 对 Ｃ 产
其序 列 ， 有 效 区 分 各 个 菌 株 ， 能 比传 统 的 细 菌 １ ６ｓ ｒ ＮＡ 分 型更 具 优势 。本 研 究 将 编码 Ｈｓ ５蛋 白 Ｒ ｐ６
患 的慢 性 、 耗 性 传 染 病 ， 世 界 动 物 卫 生 组 织 的基 因进行 克 隆 ， 序 ， 过 比较 其 序 列 ， 析 广西 消 被 测 通 分 （ Ｅ 列为必须 通 报 的传 染 病 。该病 原 菌 除感 染 牛 牛分 支杆 菌与世 界 各地 菌 株 的差 异 ， 进 一 步研 究 ＯＩ ） 为
以外 ， 还可使人 和 ５ Ｏ多种 哺 乳 动 物及 ２ ５种禽 类 感 染， 中， 其 牛是 最敏感 的动物 。 由于人 与牛 的关 系密 切， 因此 １ ％ 以上 的人 结 核病 是 由牛分 支 杆 菌 引起 Ｏ
奠定基 础 。
１ 材 料 与方 法
１ １ 材 料 ．
的 ， 可通过 吸入 含 菌 的气 溶 胶 或 食人 受污 染 的乳 人
基 因核 苷 酸序列 及推 导的氨 基酸序 列进行 分析 ， 与 Ｇ ｎ ａ ｋ上 已发表 的牛分 支杆 菌 的 Ｈｓ ５基 因进行 并 ｅＢｎ ｐ６ 比较 。结 果显 示 ， 西分 离株 ｍｔ５ 、 ３ ０与 已发表 的 ７株 参 考株序 列 ， 广 ３ ９ ｍｔ７ 其核 苷 酸序 列 同源性在 ９ ． ～ ８７ １ ０ 之 间， 导 的氨基 酸序 列 同源性在 ９ ． ～１ ０ 之 间。表 明广 西分 离的 菌株 与 参考 的其他 牛分 支杆 ０ 推 ８４ Ｏ
品； 大肠 埃 希菌工 程菌 Ｄ ａ由本 室保 存 。 Ｈ５
１１ ２ 主要 试 剂 ．． Ｔ ｑ 聚 合 酶 、 ＮＴ ｓ ＤＮＡ ａ ｄ Ｐ、
亡人 数 高 达 ３ ０万 ， 其 他 传 染 病 死 亡 人 数 之 ０ 是
和Ｌ ｊ 当属 传染 病之 魁首 。 １ ，
Ｍａｋ ｒ ｒ ｅ 等为宝 生生 物工程 （ 连 ） 限公 司产 品 ； 大 有 蛋