《过氧化物酶》PPT课件
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实验二 过氧化物酶活性的测定
2020/12/11
一、实验目的
1.学习红薯过氧化物酶的制备方 法。 2.掌握过氧化物酶的反应原理及 测定方法。
2020/12/11
二、实验原理
1、过氧化物酶（简称POD)简介 过氧化物酶广泛存在于植物体中，
是活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作 用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发 育过程中它的活性不断发生变化。一般老化组 织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因 为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合 物转化成木质素，增加木质化程度，而且发现 早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加， 所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指 标。此外，过氧化物同工酶在遗传育种中的重 要作用也正在受到重视。
2020/12/11
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本实验用紫外吸收法测定产物4－邻甲氧基苯酚在470nm 光吸收增加值表示产物增加量，划出光吸收 - 时间的速 度曲线，求出曲线的斜率，即酶促反应初速度，再换算 为酶活力。
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生 0.20 成 物 0.10 光
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收
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2.9mL 加入比色杯中。
• 放入紫外分光光度计比色杯架内，按auto zero，出现插入空白，按ok，仪器自动调零。 调零完成后按start，出现插入样品。
2020/12/11
• 如将反应速度对pH作曲线，典型的呈钟罩形，但不同酶受pH影响是不同，所 以会有不同形状，有的只有钟罩形的一半，有的则是一直线，即受pH影响不 大。
2020/12/11
胃蛋白酶
木瓜蛋白酶 胆碱脂酶
2020/12/11
• 不同酶的最适pH也不同，如胃蛋白酶为pH 1.5 - 2.5、胰蛋白酶为pH 8。但 应注意最适pH不是特征常数，对于同一种酶，其最适pH因底物的种类、浓度 及缓冲液成份不同而有差异，因此酶的最适pH并不是一个常数，只是在一定 条件下才有意义。一般最适pH在6 - 8之间。
2020/12/11
• 2．酶活力测定 • (1) 酶活力 • 表示酶量的多少不能像一般物质那样，用重量
(g)或体积(ml)。因为酶是一种生物催化剂。 酶的存在和含量多少应体现在催化能力大小， 即用酶活力(活性)表示。 • 酶活力（酶活性）指酶催化某一特定化学反应 的能力。催化能力强(大)，酶活力就高(大)， 也表示酶量多。酶本身的重量不能说明酶的实 际含量多少。同样重量的酶，酶活力可以不同， 活力高，价值就大。
2020/12/11
• 由于产物从无到有，只要方法灵敏，可准确测定。测定产物增加量的方 法很多：
• 化学方法：滴定、比色、气体测压、电化学等。 • 物理方法：UV吸收、荧光等。 • 同位素方法等。
2020/12/11
• (3) 酶的活力单位 • 表示酶活力大小，也就是酶量的大小的单位称酶的活力单位(U)。 • 国际单位(IU)定义：1个酶活力单位，是指在特定条件下，在1分钟内能转化1
• 由于酶活力受pH影响很大，因此在测定酶活力时，pH必须恒定，所以测活反 应最好在缓冲液体系中进行。
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• 本实验测定三亇不同pH下过氧化物酶的时间－光吸收关系曲线，比较三 亇不同pH ( 6.0,7.0,8.0)条件对过氧化物酶活力的影响。
2020/12/11
三、实验操作
1、过氧化物源自文库粗品液的制备 ①称取红薯材料1g，加少许石英砂及0.1mol/LpH=6.0磷酸缓冲液（2ml左右) ，
于研钵中研磨成匀浆。 ②再加入3ml磷酸缓冲液浸提20分钟后，以6000r/min离心15分钟。 ③倾出上清液并过滤，然后转入10ml容量瓶定容，摇匀后，贮于冷处备用。
2020/12/11
• 2、 酶活力测定 • (1)取1只比色杯洗净控干，按以下步骤操作： • 用移液管吸取0.1 mol/L反应液(pH 6.0)
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若将产物浓度对反应时间作图得到酶促反应 的速度曲线。
产
物
的
生
Vmax
成
量
斜率＝浓度/时间＝V
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时间
• 从图可知，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长， 酶反应速度逐渐下降。引起下降的原因很多，如底物浓度降低，产物浓度增 加而加速了逆反应的进行，产物对酶有抑制作用等。因此研究酶反应速度以 酶促反应的初速度为准，即酶促反应最初的一段时间，产物呈线性增加时的 反应速度。具体指酶促反应速度曲线的斜率。即从原点对曲线作切线，求切 线斜率( v ) = 浓度 / 时间
微摩尔( µmol)底物的酶量，或是转化1微摩尔底物中的有关基团的酶量。
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3、测定原理 过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醌类化合物，此
化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。本实验以邻 甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，在此酶存在下，H2O2可将 邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚，其反应为：
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• (2) 酶促反应速度 • 酶活力具体用它所催化的某一化学反应的反应速
度来表示，即在最适条件下(最适pH、最适T) 酶 催化的反应速度愈快，酶活力就愈高。速度愈墁， 酶的活力就愈低。所以测定酶的活力(实质上就 是酶的定量)测定就是测定酶促反应的速度(用v 表示) 。 • 酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物 的减少量或产物增加量来表示。单位：浓度/单 位时间 • 常用产物增加量表示，因为它从无到有，变化明 显。酶促反应随时间增加，产物增加。
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反应时间 （分钟）
2. pH对酶促反应速度的影响
(1) 影响酶促反应速度的因素 * 底物浓度 米氏公式 * 温度 * 酶浓度 * 激活剂、抑制剂 * pH
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• (2) pH对酶促反应速度的影响 • 大多数酶的活力受其环境pH影响。这是因为pH影响底物分子和酶分子中一些
基团的解离，这些基团的离子化状态关系到底物与酶的结合、酶的专一性和 酶活性中心的构象。通常各种酶只有在一定pH范围内才具有活性，并在一定 pH下，酶促反应具有最大反应速度，此pH称最适pH，高于或低于此值反应速 度都下降。
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一、实验目的
1.学习红薯过氧化物酶的制备方 法。 2.掌握过氧化物酶的反应原理及 测定方法。
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二、实验原理
1、过氧化物酶（简称POD)简介 过氧化物酶广泛存在于植物体中，
是活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作 用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发 育过程中它的活性不断发生变化。一般老化组 织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因 为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合 物转化成木质素，增加木质化程度，而且发现 早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加， 所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指 标。此外，过氧化物同工酶在遗传育种中的重 要作用也正在受到重视。
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本实验用紫外吸收法测定产物4－邻甲氧基苯酚在470nm 光吸收增加值表示产物增加量，划出光吸收 - 时间的速 度曲线，求出曲线的斜率，即酶促反应初速度，再换算 为酶活力。
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2.9mL 加入比色杯中。
• 放入紫外分光光度计比色杯架内，按auto zero，出现插入空白，按ok，仪器自动调零。 调零完成后按start，出现插入样品。
2020/12/11
• 如将反应速度对pH作曲线，典型的呈钟罩形，但不同酶受pH影响是不同，所 以会有不同形状，有的只有钟罩形的一半，有的则是一直线，即受pH影响不 大。
2020/12/11
胃蛋白酶
木瓜蛋白酶 胆碱脂酶
2020/12/11
• 不同酶的最适pH也不同，如胃蛋白酶为pH 1.5 - 2.5、胰蛋白酶为pH 8。但 应注意最适pH不是特征常数，对于同一种酶，其最适pH因底物的种类、浓度 及缓冲液成份不同而有差异，因此酶的最适pH并不是一个常数，只是在一定 条件下才有意义。一般最适pH在6 - 8之间。
2020/12/11
• 2．酶活力测定 • (1) 酶活力 • 表示酶量的多少不能像一般物质那样，用重量
(g)或体积(ml)。因为酶是一种生物催化剂。 酶的存在和含量多少应体现在催化能力大小， 即用酶活力(活性)表示。 • 酶活力（酶活性）指酶催化某一特定化学反应 的能力。催化能力强(大)，酶活力就高(大)， 也表示酶量多。酶本身的重量不能说明酶的实 际含量多少。同样重量的酶，酶活力可以不同， 活力高，价值就大。
2020/12/11
• 由于产物从无到有，只要方法灵敏，可准确测定。测定产物增加量的方 法很多：
• 化学方法：滴定、比色、气体测压、电化学等。 • 物理方法：UV吸收、荧光等。 • 同位素方法等。
2020/12/11
• (3) 酶的活力单位 • 表示酶活力大小，也就是酶量的大小的单位称酶的活力单位(U)。 • 国际单位(IU)定义：1个酶活力单位，是指在特定条件下，在1分钟内能转化1
• 由于酶活力受pH影响很大，因此在测定酶活力时，pH必须恒定，所以测活反 应最好在缓冲液体系中进行。
2020/12/11
• 本实验测定三亇不同pH下过氧化物酶的时间－光吸收关系曲线，比较三 亇不同pH ( 6.0,7.0,8.0)条件对过氧化物酶活力的影响。
2020/12/11
三、实验操作
1、过氧化物源自文库粗品液的制备 ①称取红薯材料1g，加少许石英砂及0.1mol/LpH=6.0磷酸缓冲液（2ml左右) ，
于研钵中研磨成匀浆。 ②再加入3ml磷酸缓冲液浸提20分钟后，以6000r/min离心15分钟。 ③倾出上清液并过滤，然后转入10ml容量瓶定容，摇匀后，贮于冷处备用。
2020/12/11
• 2、 酶活力测定 • (1)取1只比色杯洗净控干，按以下步骤操作： • 用移液管吸取0.1 mol/L反应液(pH 6.0)
2020/12/11
若将产物浓度对反应时间作图得到酶促反应 的速度曲线。
产
物
的
生
Vmax
成
量
斜率＝浓度/时间＝V
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时间
• 从图可知，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长， 酶反应速度逐渐下降。引起下降的原因很多，如底物浓度降低，产物浓度增 加而加速了逆反应的进行，产物对酶有抑制作用等。因此研究酶反应速度以 酶促反应的初速度为准，即酶促反应最初的一段时间，产物呈线性增加时的 反应速度。具体指酶促反应速度曲线的斜率。即从原点对曲线作切线，求切 线斜率( v ) = 浓度 / 时间
微摩尔( µmol)底物的酶量，或是转化1微摩尔底物中的有关基团的酶量。
2020/12/11
3、测定原理 过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醌类化合物，此
化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。本实验以邻 甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，在此酶存在下，H2O2可将 邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚，其反应为：
2020/12/11
• (2) 酶促反应速度 • 酶活力具体用它所催化的某一化学反应的反应速
度来表示，即在最适条件下(最适pH、最适T) 酶 催化的反应速度愈快，酶活力就愈高。速度愈墁， 酶的活力就愈低。所以测定酶的活力(实质上就 是酶的定量)测定就是测定酶促反应的速度(用v 表示) 。 • 酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物 的减少量或产物增加量来表示。单位：浓度/单 位时间 • 常用产物增加量表示，因为它从无到有，变化明 显。酶促反应随时间增加，产物增加。
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反应时间 （分钟）
2. pH对酶促反应速度的影响
(1) 影响酶促反应速度的因素 * 底物浓度 米氏公式 * 温度 * 酶浓度 * 激活剂、抑制剂 * pH
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• (2) pH对酶促反应速度的影响 • 大多数酶的活力受其环境pH影响。这是因为pH影响底物分子和酶分子中一些
基团的解离，这些基团的离子化状态关系到底物与酶的结合、酶的专一性和 酶活性中心的构象。通常各种酶只有在一定pH范围内才具有活性，并在一定 pH下，酶促反应具有最大反应速度，此pH称最适pH，高于或低于此值反应速 度都下降。