出口禽肉中二氯二甲吡啶酚残留量检验方法甲基化气相色谱法编制说明

《出口禽肉中二氯二甲吡啶酚残留量检验方法——气相色谱质谱检测

法》

编制说明

一、制标任务来源

本标准系国家质检总局标准委2009年标准制修订项目计划2009B680r《出口禽肉中二氯二甲吡啶酚残留量检验方法——气相色谱-质谱检测法》。

二、标准制定的目的和意义

二氯二甲吡啶酚是一种预防鸡球虫病的饲料药物添加剂，在国内养鸡业中被广泛应用。长期使用或不按规定用药会造成二氯二甲吡啶酚在动物体内和组织中残留。近年来药物残留一直是动物及动物源产品国际贸易中令人关注的焦点之一，欧盟以及美国、日本、中国都已规定并不断修订各种动物组织中二氯二甲吡啶酚残留的最高限量标准。美国、加拿大、日本和中国都规定禽肉组织中二氯二甲吡啶酚残留限量为5μg/kg。禽肝脏中二氯二甲吡啶酚残留限量为15 μg/kg.

国内外关于二氯二甲吡啶酚残留量的分析报道不多，主要有气相色谱法、液相色谱法和色谱-质谱法。气相色谱法一般通过酸酐酯化将二氯二甲吡啶酚分子中的活泼羟基去极性后形成易于汽化的衍生物，再采用电子捕获检测器检测，但检测时干扰多；液相色谱法一般需经两次固相萃取净化，前处理步骤繁多，灵敏度达不到现行限量要求，选择性也较差。因此开发一种能简单、灵敏、可靠的检测二氯二甲吡啶酚的方法具有重要的意义。

三、实验部分

1 主要仪器与试剂

1.1 主要仪器

气相色谱质谱仪、组织搅拌机、涡旋混匀器、高速离心机、旋转蒸发仪、氮吹仪、感量天平（0.1mg 和0.01g）、均质器。

1.2 试剂

甲醇（色谱纯）、正己烷（分析纯）、丙酸酐（纯度≥98%）、吡啶（分析纯）、四硼酸钠（分析纯）、中性氧化铝、超纯水。

标准品：（二氯二甲吡啶酚）购自Dr.Ehrenstorfer公司，纯度≥98％。

标准溶液（1.0 mg/mL）：溶解10.0 mg二氯二甲吡啶酚标准品于少量甲醇中，以甲醇准确定容至100 mL，配成0.10mg/mL的标准储备溶液，于4℃冰箱内避光保存。保存期为一年。

标准工作液：移取1.00mL的0.10mg/mL二氯二甲吡啶酚，相当于0.10mg的二氯二甲吡啶酚于100mL容量瓶中，甲醇定容后稀释成1.0 μg/ml的标准工作液，于4℃冰箱内避光保存。保存期为六个月。

2 样品处理

2.1 提取

准确称取样品5 g（±0.05g）于50mL离心管中，加入25 mL甲醇，均质2 min；以4000 r/min 速率离心10min。

2.2 净化

用40 mL 甲醇活化氧化铝柱，用移液管准确移取上清液20 mL于氧化铝柱，待液面与氧化铝上端表面相切时加入10mL甲醇淋洗，然后用45 mL甲醇洗脱，收集洗脱液于250mL梨形瓶中。用50 ℃水浴的旋转蒸发器将溶液蒸干。用2-3 mL 甲醇溶解残渣，并定量转入15 mL带螺旋盖离心管，用氮气流将甲醇浓缩至0.5 mL。

2.3 酯化

在上述试管中依次准确加入4 mL饱和四硼酸钠溶液，0.25mL正己烷，25μL吡啶和50μL丙酸酐。加塞，振摇1 min。在4500r/min下离心5 min，将上层正己烷移入进样小瓶中，供气相色谱质谱分析。

3 检测条件

3.1色谱条件

a）色谱柱：弹性石英毛细管柱HP-5MS：30 m × 0.25 mm × 0.25μm，或相当者；

b) 升温程序：初始温度80 ℃，保持1 min，以10 ℃/min升高到250 ℃，保持5 min；

c) 进样口温度：260 ℃；

d) 流速：1.0 mL/min；

e) 载气：氦气，纯度≥99.999%；

f) 进样模式：不分流进样；

g）进样量：1μL；

3.2 质谱条件

质谱条件

a) 接口温度：280℃；

b）离子源：电子轰击源（EI）；

c）电子能量：70eV；

d）离子源温度：230℃；

e）检测方式：SIM

f）选择离子（m/z）及相对丰度（%）：见表1。

表1 二氯二甲吡啶酚的定性离子和相对丰度比确认表

四、技术条件的确定

4.1 质谱条件

通过对二氯二甲吡啶酚丙酯全扫描后获得EI质谱图(见图1)，其特征碎片离子归属：m／z247为分子离子，m／z191为二氯二甲吡啶酚分子，m／z193 和m／z195为m／z191的C1同位素峰。为此，选择m／z191，193及195为特征离子，采用SIM模式对二氯二甲吡啶酚进行定性和定量分析。

图1二氯二甲吡啶酚丙酯的全扫描质谱图

4.2 色谱条件

在程序升温试验中，选择起始温度80℃，既可保证溶剂在3min内出峰，保护离子源灯丝，又可加快二氯二甲吡啶酚丙酯的出峰，减少分析时间，提高灵敏度；

4.3 提取方法

对于样品的提取．原来标准采用震荡抽滤的方法，要加入助滤剂改善过滤速度。本方法采用均质后将离心管以4000r／min离心10min后移取部分上清液进行后续净化操作，使过程简化。实践表明，采用此方法可使提取更完全，提取率更高且更稳定。离心分离后，液相清澈，液固界面非常明显。另外，直接移取部分上清液进行后续净化，这样可以避免了过滤后滤渣洗涤是否完全的问题，所以实验重现性较好。为了有效地提取鸡肉组织中的二氯二甲吡啶酚残留，采用甲醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷等不同有机溶剂进行提取试验。试验中发现，丙酮与甲醇的提取回收率相当，但丙酮提取液中脂肪等杂质的含量相对高些；乙酸乙酯和二氯甲烷难以从未除去水的鸡肉组织中提取氯羟吡啶，回收率低。因此，本实验最终选择甲醇作为提取溶剂。

4.3 净化方法

在实验中还对市售氧化铝固相萃取(SPE)小柱的净化效果进行了试验，结果表明这些小柱都不能很好地除去脂肪等杂质。为此，采用自装填氧化铝层析柱净化提取试液，结果发现，氧化铝层为5g 和10g的层析柱回收率较低， 15g和20g的层析柱回收率高，二者差异不明显，洗脱液也相对干净。因此选择氧化铝层的填充质量为16g。

4.4 线性范围

二氯二甲吡啶酚标准品浓度在20μg/L～240μg/L内,浓度与响应值呈线性关系。 (相关系

数>0.99)

4.5 回收率、精密度和定量检测限

以不含二氯二甲吡啶酚的鸡肉和鸡肝为检测样品，采用外加法在样品中分别添加三个不同浓度的水平的二氯二甲吡啶酚，作回收率和精密度试验，见表2，其标准溶液及鸡肉中5.0μg/kg，

10.0μg/kg，20.0μg/kg添加水平的样品溶液图谱以及鸡肝中10.0μg/kg，15.0μg/kg，30.0μg/kg 添加水平的样品溶液图谱见图2～10。

定量检测限：鸡肉中二氯二甲吡啶酚的检测限（LOQ）为5.0μg/kg。鸡肝中二氯二甲吡啶酚的检测限（LOQ）为10.0μg/kg。

品种添加水平

(μg/kg)

回收率(％)

平均回收率

(％)

RSD(％)

鸡肉5

70.1 72.5 91.7 72.2

80.612.6

80.3 96.5 73.7 87.5

10

71.1 94.6 76.7 79.3

79.9 9.8

73.1 84.1 74.6 85.3

20

81.9 70.3 73.5 76.2

78.7 8.9

71.4 88.4 80.3 87.5

鸡肝10

75.2 86.3 70.5 74.8

80.1 10.1

71.7 81.7 91.2 89.1

15

80.3 73.4 89.4 76.8

82.3 8.8

75.3 93.5 87.4 82.4

30

86.4 92.4 81.3 76.5

85.1 7.8

83.6 79.8 96.7 84.1