疟原虫血片制作

疟原虫血片的制作
一、需要材料
1.采血器材：75%酒精棉球、一次性采血针、玻片、推片、铅笔、
干净的绸布或化纤布。

2.染色材料：
①姬氏原液
②.蒸馏水或纯净水:①稀释姬氏原液②染色时冲洗染液
③固定剂：①用甲醇或无水乙醇（乙醇含量达99.9%），固定薄血膜②用无水乙醇擦洗油镜头。

④脱油剂：无水乙醚或二甲苯：镜检后的血片脱镜油。

油镜头脱油可用无水乙醚：无水乙醇的7:3混合液擦拭。

⑤擦镜纸。

二、采血前准备：
1.玻片准备
⑴我们现在用的玻片都是除去油渍的脱脂玻片，使用前可用
绸布擦去玻片上纤维和浮灰，即可使用。

⑵新的尚未脱油脂的玻片：用洗衣粉水洗净后，一一浸泡于
95%的酒精中约一周时间，然后一一取出，用软而洁净并没有棉花纤维的细布擦干，擦亮，收藏好。

⑶已用过的旧玻片：先消毒后用洗涤剂清洗，去除污渍，再
一一浸泡于95%的酒精中约一周时间，然后一一取出，用软
而洁净并没有棉花纤维的细布擦干，擦亮，收藏好。

2.玻片编号：在玻片的磨砂端用铅笔进行编号。

玻片编号、检验报告单号和登记号应一致，并具有唯一性。

3.采血时间：
⑴间日疟、三日疟原虫患者可在发作的任何时间进行采血，但由于患者刚发冷发热以后，大部分是在环状体期，故这一时期区别疟原虫种类是不容易的。

所以在发作后的6～8小时内采血为最佳，这时环状体以滋养发育成晚期滋养体，较易识别。

⑵。

恶性疟原虫;从理论上讲，因为恶性疟原虫的裂体生殖是在内脏的毛细血管内进行的，所以在发作之前，患者的末梢血液中不易查到，但实际情况不尽如此，一般在受感染者的末梢血液中，随时能见到少量的恶性疟原虫的环状滋养体；虽然如此，较理想的采血时间，是在发作后的20小时左右，因为这个时候，环状体虽已发育至最高峰，但尚未回到内脏毛细血管中去进行裂体生殖。

环状体的数量和构造。

有助于疟原虫种类的鉴别，恶性疟原虫的配子体很容易识别，但在初发时，一般需要在发作7～10日后才能在末梢血液在出现，应当注意。

4.采血的部位和方法；
部位：以耳垂采血为主。

若由指头取血则受检者痛楚较大，且容易引起创口感染，一般不易采用。

婴儿可采集足跟或拇指。

方法：让受检者位于我们右前方，采集右耳垂血液，这样便
于方便操作，以75%酒精棉球消毒耳垂，（在消毒前挤出多余酒精）待酒精干后，左手拇指和食指紧捏耳垂，右手持一次性采血针迅速刺入，稍用力挤压（酒精不干不能挤压，以免血液流出不成滴状，也不可用干棉花拭去多余酒精，因干棉花中碎纤维较多而污染血膜），采血后应尽快制作血片，时间过长会形成纤维蛋白，出现凝血。

5. 厚、薄血膜制作，染色：
⑴厚、薄血膜的形态和位置：
薄血膜：宽2㎝，长2.5㎝.
厚血膜直径0.8～1.0㎝.
假定将玻片划成三等分，则厚血膜应位于中格靠右侧线处，薄血膜则从玻片中央起至左格中部止，右端空格供记录姓名，编号或贴标签用。

⑵厚血膜制作：待血液滴呈绿豆大小时，血量大约4～5ul用推片的左端下角刮取血滴，放于载玻片的右侧，自内向外涂成0.8～1.0cm直径的血膜，涂片结束前回转一下，使厚血膜均匀。

厚血膜制作完毕，用酒精棉球擦去玻片上的血迹，再用干的干净的布拭去残留的酒精，厚血膜的厚度以一个油镜视野内可见到5～10个白细胞为宜。

⑶薄血膜的制备：用推片中央沾取一小滴血, 在玻片左侧距离厚血膜约0.5cm处，与载玻片接触，推片与玻片约成25°～35°夹角，当血液沿推片的边缘扩展至2㎝宽时向左边匀速推成舌
状薄血膜。

推成的血膜约成2cm宽×2.5cm长的薄血膜，薄血膜的用血量较少，约是厚血膜的1/10约为1.0ul～1.5 ul（有推荐用0.5ul～1.0 ul）即可。

推片速度的快慢和角度均影响薄血膜的厚薄程度，最理想的薄血膜是一层血细胞，血细胞的分布排列比较均匀，无裂缝、无空泡。

采血完毕，用干棉花擦拭耳垂上的血液，推片上的血迹用酒精棉球擦去，再用干布擦干待用（不能使用掉纤维的布）。

无论在擦拭玻片，制作血片或染色血片时，手指切勿触及玻片之上下面以免手上油脂污及玻片面，使薄血膜涂布不均厚血膜易于脱落。

另外推片手持端应作标记，两端尽量不要混拿，以免人手经常拿捏，推片受到手上的油渍污染而影响血膜质量。

⑷血片干燥
制成的血膜必须完全干燥后方可进行固定染色，否则薄血膜中红细胞边缘褶皱，厚血膜染色时易脱落，而出现网状的背景。

反之，血片放置过久则有霉菌及枯草杆菌生长，血红蛋白凝固，也不能镜检。

薄血膜在自然情况下约需10分钟，厚血膜需30分钟。

应将血片用有盖器皿罩住，防灰尘落入，放37℃温箱，20分钟可干透。

放入温箱干燥时间不能超过1周，否则染色后厚血膜背景颜色较深，影响观察。

厚血膜如不能及时染色时，先将薄血膜固定，夏天应在48小时内，冬天应在72小时内对厚血膜进行溶血处理（不适用抗凝血），干燥后再保存。

否则厚血膜会自然固定而不能溶血，影响镜检。

注意：制成的血片切勿用火烤、日晒或放在新购置的标本盒内，以免血红蛋白凝固无法脱掉。

血片放置待干时不可倾斜，否则厚血膜中血细胞沉在一边，可使厚薄不均。

此外，还要防止苍蝇吮吸和灰尘污染。

⑸.固定、染色（姬氏染色法）
①干燥后的血片用棉签蘸取甲醇或无水乙醇在薄血膜上轻轻涂抹（最好是将甲醇倒入一个干净的50mL小烧杯中，将薄血膜浸没其中，以减少棉签中的灰尘和碎纤维的污染），注意不要碰到厚血膜，否则使血红蛋白凝固，厚血膜不能镜检，约1～2分钟血片干后，即可进行染色。

②染液的稀释：
染液在临用前要进行稀释，上面发放的姬氏为原液。

其稀释方法：8m水(到空染色瓶的颈部)加10滴原液，染20～25min，实际工作中我们经过比对，觉得8mL水加14滴原液能达到较为满意的效果，并根据血片的数量，按每张血片滴加染液1.5～2mL的量，配制稀释液量，稀释后的染色液最好一次用完，放置过久影响着色效果。

若厚血膜过厚，可先滴加蒸馏水数滴溶去血红蛋白，约需2min，时间不宜过长，否则血膜易脱落，倾去蒸馏水，待血膜干后再滴加染液染色，或直接在厚血膜上滴加2滴蒸馏水后，不倒去蒸馏水即刻直接滴加稀释染液（注：这两种方法对抗凝血不适用）使染液覆盖整个血膜。

夏天染25～30min即可，冬天需40～
60min能达到较为满意的效果。

⑹冲洗、干燥：血片染到时间后，用蒸馏水冲洗，冲洗时不能对准血膜冲，应在无血膜地方注加蒸馏水，使染液溢出，直到染液冲洗完，切不可先倒去染液，否则染液残渣吸附在血膜上即便再冲洗多遍也无济于事，或在一个盆中放入足够多水，将血片和染液一同浸入水中漂洗并在水中摆动几下(对于用抗凝血制成的血片，在冲洗时厚血膜极易脱落，所以只能用此种方法漂洗)，对去除灰尘和染液残渣效果比较好。

冲洗好的血片放于自然环境下1～2h，或37℃温箱20min左右即可镜检。

⑺染色效果判断：
着色较好的血膜，红细胞呈淡红色，嗜酸性粒细胞的颗粒呈桔红色，嗜中性粒细胞核呈紫蓝色，中性粒细胞胞浆颗粒呈淡红色，淋巴细胞及疟原虫胞浆呈蓝色或淡蓝色，疟原虫核呈红色。

除环状体外，其他各期均可查见疟色素。

⑻影响染色效果的因素：●染料和溶剂的质量：染料、甲醇和甘油如不纯，常使配成的染液偏酸或偏碱，影响染色结果。

因此，必须用分析纯的甲醇和中性甘油，配制时所用器具必须干净无水。

●染液的新旧：新配制的染液，一般着色力较弱，常呈碱性。

染液放置时间稍长，染色力逐渐增加，故应在染色前1～2周先将染液配好。

盛染液的瓶子应密封，以免影响染液质量●染液稀释后的使用时间：染液稀释后，一般在半小时内使用，时间太长也会影响染色效果●染液的浓度：染液浓度
高，着色快，各种细胞着色深，薛氏点、茂氏点等粗大显著；染液浓度低，着色慢，但各种细胞内部结构着色均匀、清晰，如环状体、子孢子及疟色素等颜色分明，但薛氏点、茂氏点不够清楚。

●染色时间（应根据染液的质量、新旧、浓度和气温决定）；染色时间长，染色效果好，温度高着色快，●染色用水的PH值（7.0～7.2）：当染色太蓝，可用PH较低的缓冲水冲洗；如染色太红，则用PH较高的缓冲水冲洗；如染色太深，可延长冲洗时间，予以纠正。

●冲洗方法：染色后不能直接将染液倒掉。

应将玻片连同染液一起放入水中漂洗，或沿玻片及染色缸边缘加水使染液表层溢出，并轻轻冲洗，以免染色颗粒沾污血膜。

姬氏染色效果稳定，染色时间和染液浓度对结果影响较小，染色后的血膜保存时间较长，同时姬氏染剂能长期保存而不变
质，染色技术也易掌握，被推荐使用，瑞氏染色法因操作简便，常用于个别血片染色。

三、镜检工作中所注意的事项
1. 在镜检中显微镜的使用：油镜、凹镜、视野需按一定的顺序逐个检查。

2.疟原虫镜检工作中，凡是发热病人。

疟疾、疑似疟疾、及不明原因的发热病人均需要进行疟原虫镜检。

3. 做好镜检登记：凡是镜检疟原虫的均需如实登记，阴阳性片保存待查，
4.如发现恶性疟以最快的通信方式上报。

四、实际工作中我们发现的几个常见问题归纳如下
1.血片制作不规范比较常
①厚血膜血量较大，薄血膜用力不均匀，薄血膜制作较厚
②血膜位置不规范，厚、薄血膜安排不当。

厚、薄血膜
间距离相隔过大
③血膜太靠近玻片的边缘。

④厚、薄血膜位置颠倒，方向错误，将薄血膜沿着厚血
膜方向推，厚、薄血膜易相触
2.将姬氏染色方法与瑞氏染色方法混淆
①姬氏原液不稀释，直接滴加在血膜上，使厚、薄血膜
均被固定。

厚血膜一团黑，不能镜检。

②薄血膜未固定，直接用姬氏染色，薄血膜脱落。

3.染色时间不够，滴加染液后很快冲洗，加上薄血膜未固定，使厚、薄血膜全部脱落。

4.甲醇或无水乙醇固定剂只能固定薄血膜，千万不能固定厚血膜，有的将厚、薄血膜上都滴加固定剂，结果厚、薄血膜全被固定。

厚血膜一团黑无法镜检。

5.显微镜使用不当：镜检时使用高倍镜头，不使用油镜头，使用高倍镜镜检间日疟勉强应付，恶性疟原虫使用高倍镜难以观察。

6.血膜脱落的原因：
①血膜未干透即染色②玻片上有油污：玻片未清洗干净;手接触
玻片血膜面；③血膜过厚；④冲洗时水压大（尤其使用抗凝血）。