氨基酸聚酰胺薄膜层析

氨基酸聚酰胺薄膜层析——DNS-Cl法

一、实验目的：

1．掌握聚酰胺薄膜层析技术的基本方法和应用。

2．熟悉蛋白质及肽的N末端氨基酸DNS分析法。

二、实验原理：

.1.层析技术

①概念：是利用化合物中各组分的物理性质的差别（如溶解度、吸附能力、分子形状和大小、分子极性等）使各组分在两相中的分布不同，从而使各组分以不同速度随流动相向前移动而达到分离的目的。

②特点：分离效率高，能分离各种性质相类似的物质。不仅可用于少量物质的分离纯分，也可用于大量物质的分离纯化和制备。

③层析法的分类

气相层析（以气体为流动相的层析法）

液相层析（以液体为流动相的层析法，此为生物化学领域里常用的方法）

I.吸附层析：薄层吸附层析、吸附柱层析

II.分配层析：纸层析、柱层析、薄层层析

III.离子交换层析

IV.凝胶层析：柱层析、薄膜层析

V.亲和层析

④纸层析法(paper chromatography)是生物化学上分离、鉴定氨基酸混合物的常用技术，可用于蛋白质的氨基酸成分的定性鉴定和定量测定。纸层析法是用滤纸为支持物进行层析的方法，所用展层溶剂大多由水和有机溶剂组成，滤纸纤维与水的亲和力强，与有机溶剂的亲和力弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。溶剂由下向上移动的，称上行法；由上向下移动的，称下行法。将样品点在滤纸上(此点称为原点)，进行展层，样品中的各种氨基酸在两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同，不同氨基酸随流动相移动的速率就不同，于是就将这些氨基酸分离开来，形成距原点距离不等的层析点。

溶质在滤纸上的移动速率用Rf值表示：Rf=原点到层析斑点的距离/原点到溶剂前沿的距离在一定条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、温度、湿度、层析滤纸的型号和质量等因素有关。只要条件(如温度、展层溶剂的组成)不变，Rf 值是常数，故可根据Rf值作定性判断。

样品中如有多种氨基酸，其中某些氨基酸的Rf值相同或相近，此时如只用一种溶剂展层，就不能将它们分开。为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转动90度，再用另一溶剂展层，从而达到分离目的，这种方法称为双向纸层析法。

氨基酸无色，可利用茚三酮显色反应，将氨基酸层析点显色作定性、定量用。

2.荧光试剂二甲氨基萘磺酰氯(dansyl-Cl，简称DNS-C1)在碱性条件下与氨基酸(肽或蛋白质)的氨基结合成带有荧光的DNS-氨基酸(DNS-肽或DNS-蛋白质)，DNS-蛋白质再经酸水解可释放出DNS-氨基酸。

DNS-C1能与所有的氨基酸生成具荧光的衍生物，其中赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨基酸可生成双DNS-氨基酸衍生物。这些衍生物相当稳定，可用于蛋白质的氨基酸组成的微量分析，灵敏度可达10－10～10－9mol水平，比茚三酮法高10倍以上，比过去常用的FDNB法高100倍。将Edman法和DNS法结合起来(称为Edman-DNS法)应用于蛋白质结构的序列分析上作，可以提高Edman法的灵敏度及其分析速度。DNS-氨基酸衍生物在6mol/L盐酸中105℃水解22小时，除DNS-色氨酸全部被破坏，DNS-脯氨酸(77％)，丝氨酸(35％)，甘氨酸(18％)，丙氨酸(7％)部分被破坏外，其余DNS-氨基酸很少破坏。故DNS法可用于蛋白质和肽的氨基酸组成N末端分析。

DNS-C1与蛋白质的侧链基团巯基、咪唑基、ε-氨基和酚羟基反应，前两者在酸碱条件下均不稳定，酸水解时完全破坏；DNS-ε-赖氨酸和DNS-O-酪氨酸较稳定，同时还有DNS-双-赖氨酸和DNS-双-酪氨酸生成，层层后在层析图谱的位点上，都与DNS-α-氨基酸有区别。

聚酰胺是—类化学纤维原料，即锦纶(又称尼龙)。由己二酸与己二胺聚合而成的称锦纶66 。因为在这类物质分子中都含有大量酰胺基团，故统称聚酰胺。它对很多极性物质有吸附作用，这是由于聚酰胺的一C＝O及>NH基能与被分离物质之间形成氢键。如酚类(包括黄酮类、鞣质等)和酸类<如核苷酸、氨基酸等)是以其羟基与酰胺键的羰基形成氢键；硝基化合物和醌类等物质与酰胺键的氨基形成氢键。被分离物质形成氢键能力的强弱，确定吸附能力的差异。在层析过程中，层层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键。因此选择适当的展层溶剂，使被分离物质在溶剂与聚酰胺表面之间的分配系数能有较大差异，经过吸附与解吸的展层过程，可以一一分离。

三、实验用品：

1.实验器材

聚酰胺薄膜（7cm×7cm）、小钟罩、吹风机、小离心管、毛细管、紫外分析仪、小培养皿、移液枪

2.实验试剂

PH9.9 的标准赖氨酸、丙氨酸、苯丙氨基酸，混合氨基酸、展层液（以甲酸：水==1.5:100配制）

四、操作方法：

1.DNS-Cl标记PH9.9的标准氨基酸

取4个小离心管，分别加入三种标准氨基酸以及混合氨基酸各30微升，在各加入30微升DNS-Cl丙酮溶液，充分混合（避光）。然后将4个离心管在37度水浴中保温1h。

2.点样

在距边1cm处画一基线，在上面每隔1 cm画—点作为点样位置。用毛细管取样，点在聚酰胺薄膜点样位置上，点子直径不得超过2mm，若需要多次点样时，应当将第一次样品点吹干后，再点第二次。

3.展层

将点完样的聚酰胺薄片光滑面向外，聚酰胺面向内，箍以橡胶圈。层层容器用烧杯套住，内放一小培养皿，倒入5-10 mL展层溶剂进行展层，以溶剂前沿走到距边约0.3cm为度(约10～20分钟)，取出薄片，然后用吹风机吹干。

4.透射

将聚酰胺薄膜至于紫外分析仪中，观察荧光斑点

五、实验结果：

图1 实验结果图谱（铅笔勾线）（）

由原理可知，当DNS-Cl过多时，会产生DNS-NH2，后者在紫外光照射下呈现蓝色荧光。由此可解释每组中的蓝色荧光斑点现象。而赖氨酸与DNS-Cl反应生成DNS- -赖氨酸的同时也生成了DNS-双-赖氨酸，所以赖氨酸组中有两个黄绿色荧光斑点，一个为点状，另一个呈V字形。丙氨酸中只有一个四边形黄绿色荧光点，苯丙氨基酸也只有一个不规则黄绿色荧光点。而混合样品中有三个不规则黄绿色荧光点以及一个V字形黄绿色荧光点，可知它

含有三种氨基酸。