基因突变技术

基因突变技术：用酶学和化学方法来切割或合成 DNA，同时将突变碱基或序列导入克隆化的基因 中，重组后回到生物体，引起生物功能的改变。
限制性内切酶法

在基因内部若有酶切点， 如EcoRⅠ酶切后， 尾修平或补平后，分别可减少/增加4个碱基。
加dNTP和DNA聚合酶补平
5’GAATT CTTAA （增加4bp）
基因突变
第一节 第二节 第三节 第四节 基因突变的基本概念 基因突变的分类 随机突变 DNA的定位诱变及点突变技术

第一节

基因突变的基本概念


基因突变（gene mutation）是基因组DNA分子在结构 上发生碱基对组成或排列顺序的改变（通常它只涉及 基因中部分序列的变化），并引起个体表型的改变, 而 使生物体发生遗传性变异。（基因突变技术） 在自然界中生物体由于受到某种突变剂的作用，偶然 会由于基因复制的错误而发生突变，这种突变称为自 发突变（spontaneous mutation）。 自发突变的频率较低，基因的每个核苷酸突变率平均 为 10-9～10-10。相反如果在人为条件下，使用某种突 变剂处理生物体而产生的突变称为诱发突变（induced mutation）。诱发突变频率高得多（千倍以上），而 且现在可在离体条件下，使细胞发生定向诱发突变， 称为定向突变。 有生殖细胞突变和体细胞突变。
二、碱基插入突变

碱基插入突变是指基因组DNA链中插入1个 或几个碱基对, 这种突变可以引起其后DNA 序列的读框发生改变, 故又称为移框突变 （frameshift mutation）。移框突变的结果 不但改变了表达产物的氨基酸组成，而且 会出现新的终止密码子，而使蛋白质合成 过早终止。 转座子或IS的插入常会造成基 因失活。
第二节

基因突变的分类
一、点突变 二、碱基插入突变 三、碱基缺失突变
碱基替代（点突变），碱基插入或缺失结 果，从对三联体密码的影响及遗传信息的改变 来看，又有下述几种不同的情况发生： ㈠ 同 义突变（Synonymous niutation） ㈡ 错义突 变（ncissense mutation） ㈢ 无义突变 （nonsense mutation）
第三节


随机突变

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一、限制性内切酶法 二、接头插入法 三、系列缺失法 如图8-3（a）方法一 （b）方法二 四、核苷酸随机取代法
DNA的定位诱变及点突变技术

一、区域随机诱变 二、基因的点突变技术 三、点突变技术的应用
一、点突变
点突变又可分为单点突变（Single point mutation）和多点突变（multiple mutation）。 单点突变是指只有一个碱基对发生改变，而多点 突变是指有两个或两个以上碱基对发生改变。点 突变可以是碱基替换（base substitution）, 碱基 插入（base insertion）和基因缺失（base deletion）但点突变这个术语常常是指碱基替代。 碱基替代又可分为两类, 一类叫转换 （transition），即嘌呤被另一嘌呤取代或嘧啶被 另一嘧啶取代后而发生的变化（如图8-1）。另 一类叫颠换（transversion）即嘌呤被嘧啶或嘧 啶被嘌呤取代后而发生的变化。点突变的重要特 点之一是它具有很高的回复突变率。如图8-1。
DNA的定位诱变技术
定位诱变技术就是指按照设计要求， 在体外将基因特定区域的碱基进行突变， 这样就有可能在缺乏表型选择时进行遗 传分析，以便于研究基因结构与功能的 关系和基因表达调控的过程。其诱变技 术有两种类型，即区域随机诱变和点突 变。
一、区域随机诱变
区域随机诱变是在含有靶位点的一段DNA序 列上引入随机碱基序列而发生基因突变。 1. 切割分离基因片段后用诱变剂处理，在重 新接到载体上进行表达 2. 将靶基因加工成单链区，用单链DNA诱变 剂处理（使C变U），用聚合酶双链化和 复制时，使原先的G/C发生A/T转换
错义突变

错义突变是指碱基序列的改变引起了产物 氨基酸的序列改变。有些错义突变严重影 响到蛋白质活性甚至完全失去活性，从而 影响了表型。如果该基因是必需基因，则 该突变为致死突变。
无义突变
无义突变是指某个碱基的改变可使某种氨基 酸的密码子突变为终止密码子。如赖氨酸的密码 子AAG突变为终止密码子TAG, 酪氨酸的TAC突 变为TAA或TAG终止密码子。若无义突变的终止 密码子使肽链合成过早终止, 因而蛋白质产物一般 没有活性,若是发生在基因DNA的3’末端处, 它所 表达产生的多肽常有一定活性或有部分活性, 这种 突变又称为渗漏变型（leaky mutation）。
随机突变
随机突变是指目的基因发生突变的部位是随 机的, 如PCR克隆基因时, 往往产生不确定序列的 突变。在Tag酶的作用下, 有时在遇到模板中的AT对时, 倾向于掺入G-C对, 而使基因序列发生改变。 随机突变常用于鉴定克隆的DNA中特定功能在基 因序列中所处的位置及其与周围序列的关系。如 果对所克隆的DNA特定序列所编码的产物及其功 能知之甚少，可采用随机突变法进行研究，以确 定功能区域有助于缩小研究范围。
二、基因的点突变技术
点突变的技术有很多种，常见的有寡核苷酸 介导的点突变技术和PCR定点突变技术。 ㈠寡核苷酸介导的定点突变技术


1.寡核苷酸引物诱变技术 2.盒式诱变 如图8-7 1.引物PCR定点诱变法如图8-8 2.重组PCR定点诱变法如图8-9

㈡ PCR点突变技术

基因突变技术
三、碱基缺失突变

基因缺失突变是指基因组DNA链中缺失1个 或数个甚至小片断的碱基对。这种突变也 可引起其后DNA序列的读框发生改变。 如 图8-2
同义突变

同义突变是指碱基被替代后, 没有改变产物 氨基酸序列, 这是与密码子的简并性相关, 如CTT、CTC、CTA、CTG的第3位碱基互 相替代后其编码表达的产物均为亮氨酸, CTT、CTC、CTA、CTG的第3位碱基互相 替代后, 其编码表达的产物均为脯氨酸,因此 这种突变不产生突变效应。