农杆菌介导的拟南芥转基因技术方法探究

农杆菌介导的拟南芥转基因技术方法探究
农杆菌介导的植物转基因技术在研究植物基因功能、改良作物农艺性状等方面发挥着重要作用。

拟南芥作为模式植物，是研究植物基因功能的重要材料。

本文主要介绍农杆菌介导的拟南芥转基因方法——浸花法。

该方法操作简单，转化效率高，易于在中学生物实验教学中推广。

通过该实验，可以培养中学生对于生物学科的兴趣，提高学生对于生物知识的理解力和创新能力。

标签：植物转基因；农杆菌；浸花法
植物转基因技术是指把目的基因通过各种方法转移到植物基因组中，使之稳定遗传。

利用该技术研究基因在植物个体生长发育以及生理代谢过程中功能，研究成果可应用于农艺性状的改良、植物经济价值和观赏价值的提高等方面。

植物基因转化的方法可分为直接转化和载体介导两种转化方法。

基因直接导入法直接将外源目的基因导入植物的基因组中，包括基因枪转化法、电激转化法、超声波法、显微注射法和激光微束法、PEG 介导转化方法、脂质体法和花粉管通道法等；载体介导的转化方法需要将目的基因插入到改造后的农杆菌质粒或病毒的DN分子上，利用农杆菌或病毒对植物的侵染作用将目的基因导入到植物基因组中。

农杆菌介导的转化方法具有应用范围广，转化率高，单拷贝比例高，转化子稳定等特点，是植物转基因研究中的常用转化方法。

农杆菌能在自然条件下感染大多数双子叶植物受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。

在农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，农杆菌中Ti质粒上的T-DNA可以插入到植物基因中。

科研人员经过长期的研究，将目的基因插入到经过改造T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移和整合，从而获得转基因植株。

利用农杆菌介导的转化方法进行转基因操作时，根据植物材料的不同，采用不同的转化方法，如在烟草转化时常采用叶盘法，而水稻转化则采用愈伤组织转化的方法。

浸花法（floral tip）是拟南芥转化最常用的方法。

这种转化方法不需要组织培养和再生植株的过程，操作简便、转化效率较高，为科研人员提供了极大的便利。

鉴于此，将农杆菌介导的拟南芥转基因操作引入高中生物实验教学，可以增加学生对于植物转基因技术的了解，丰富学生的知识，培养学生对于生物研究的兴趣，提高学生对于生物知识的理解力和创新能力。

一、材料和方法
1.植物材料
哥伦比亚野生型拟南芥。

野生型拟南芥种子种植于蛭石中，放在4℃低温处理24h，然后将培养盒置于22±1℃光照下使其萌发生长。

2.药品试剂
（1）含有pBIN-mGFP质粒的农杆菌GV1301悬浮液（对数生长期）：将植物转基因载体pBIN-mGFP转入农杆菌GV1301，卡那霉素（50mg/ml）筛选含有pBIN-mGFP质粒的菌落。

将重组农杆菌接种在LB液体培养基（含25mg/L庆大霉素和50mg/L卡那霉素）中，28℃，180r/min条件下震荡培养至对数生长期。

（2）浸染液：含有5%蔗糖和0.02% Silwet L-77的水溶液。

3.实验方法
（1）农杆菌侵染液的准备：①将培养至对数生长期的农杆菌转入离心管中，室温条件下，以6000 rpm/min转速，在离心机中离心10分钟，然后将上清倒出。

②将农杆菌沉淀用200 ml浸染液重悬在500 ml烧杯中。

（2）植物材料准备：拟南芥生长5-6周，此时最大花序已产生第1个角果。

转化实验前一天停止浇水。

（3）浸花法转化拟南芥。

①选取初果期的健壮拟南芥植株，将花序浸入农杆菌悬浮液中约30秒，注意叶片尽量不与浸染液接触。

同一个烧杯中的农杆菌悬浮液可以转化10株或者更多株拟南芥。

在此过程中，尽量避免将蛭石倒入农杆菌悬浮液中。

②将拟南芥培养盒放于温室暗处，约24小时。

③24小时后将拟南芥植株放于温室光照条件下正常生长。

④生长约4周时角果变黄，用纸袋将植株套住。

再过1周后剪下植株，收种子，在恒温培养箱中干燥1周后放到4℃中保存。

（4）拟南芥转基因植株的筛选。

①种子灭菌：将收获的拟南芥种子置于1.5ml 离心管中，加入70%乙醇，处理约1min，然后将乙醇用移液器吸走，离心管中加入5%次氯酸钠溶液，处理5min，最后用无菌水洗5次，每次2min。

②种子在筛选培养基上面萌发生长：将消毒好的拟南芥种子撒播在含卡那霉素50mg/L 的1/2MS培养基中，将培养皿封口置于4℃冰箱中春化2-3天，然后置于22±1℃光照培养箱中生长。

参考文献：
[1] 张献龙. 《植物生物技術》[M]. 第二版. 北京：科学出版社，2012.
[2] 张蕾，赵洁. 《植物发育生物学实验指导》[M]. 第一版. 武汉：武汉大学出版社，2010.
[3] Clough S J，Bent A F. Floral dip： a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana[J]. Plant J，1998，16：735-743.。