总胆汁酸检测 共24页PPT资料

循环法测定胆汁酸
【试剂】 1．试剂Ⅰ 硫代-NAD 2mmol/L，Good’s缓冲液
200mmol/L，pH7.0。 2．试剂Ⅱ 3α-HSD 15kU/L，NADH
3mmol/L,Good’s缓冲液200mmol/L,pH8.0。 3．标准液 同比色法。 【操作步骤】自动化分析法。 • 反应类型：速率法； • 反应温度：37℃； • 波长：405nm(主)/660nm(次) • 样品3μl； • RⅠ200μl；3～5min后加RⅡ50μl, • 延迟时间1min • 读数时间4min。
②设定试剂针、样品针和反应杯的补充清洗程序, 也可大大减低试剂之间的交叉污染。
③减少胆酸盐含量高的试剂盒的使用
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循环法测定胆汁酸
【评价】
1．干扰试验结果表明 胆红素＜850μmol/L， 血红蛋白＜5g/L，抗坏血酸＜2.84mmol/L，乳酸 ＜24mmol/L，乳酸脱氢酶＜10 000U/L时，偏差 均＜±5%，说明几乎不存在内源性干扰,但外源 性干扰如仪器的携带污染同样存在,可用比色法 中阐述的方法排除。
胆汁酸测定常见问题
☆ 结果出负值 试剂正常时，此现象出现几
率应该很低；但也不能100%排除 （尤其是标本中TBA含量很低时） 定期做试剂空白校准是必要的。
☆ 交叉污染
多项目同时测定时，TBA结果经常会偏高；单独 复查时，结果又正常：是目前较常见的现象。这 是因为：有些试剂组分中添加了较高浓度的胆酸 盐,胆酸盐具有胆汁酸的反应特性,自动分析仪器 的试剂针引起携带污染
酶比色法测定总胆汁酸
-----注意事项
由于血清中TBA含量低，样品中存在干扰物质的 影响相对就大，乳酸脱氢酶(LD)是主要的干扰物质， 由LD反应中生成的NADH往往比TBA反应中生成的量 要大得多，因此测定前去除血清中LD的影响至关重 要，方法有：血清67℃加温30min；加草氨酸作为 LD的封闭剂；碱或酸处理；用丙酮酸钠抑制LD活性。 上述5种方法中丙酮酸钠法最好，可免去前处理步 骤，直接加入反应体系，不影响体系的pH，且对反 应无干扰。 血清中还存在其它脱氢酶(有相应底物存在时)和 还原性物质，如不除去，测定结果会偏高。据无选 择的40例肝功能标本的测定结果来看，平均干扰相 当于TBA 18μmol/L，范围在5.5～45μmol/L之间。 因此自动分析设计成双试剂二步法，样品先和不加 3α-HSD的体系孵育，使样品中的干扰物质先反应， 然后再加入3α-HSD，启动TBA反应。
孕妇测定TBA的重要性
• 妊娠期肝内胆汁淤积症（ICP）是发生在妊娠中晚 期以皮肤瘙痒和黄疸为特征的疾病，胆汁淤积可 导致胆小管内形成胆栓，血清中TBA的浓度升高， 如不能早期诊断及时对症处理，可引起早产、胎 儿窘迫、死胎、新生儿死亡及产后出血等母婴不 良后果，列入高危妊娠范畴。临床对典型ICP诊断 以出现皮肤瘙痒或不伴黄疸，血清TBA、ALT和ALP 升高为依据，其中TBA测定作为ICP的敏感指标， 对ICP有重要和早期诊断价值。
◆ 急性肝炎时，血清TBA浓度和ALT活力同时升高，
分别在正常高限的3、4倍和30倍，两者呈高度正 相关;慢性肝病时升高幅度虽不大，但均在正常值 上限或2倍左右;肝硬化时ALT和肝功能指标未发生 明显改变时，血清TBA浓度明显升高。TBA是反映 肝细胞损害非常灵敏的指标。
◆ 肝硬化时，血清TBA比慢肝升高幅度大，而ALT和 常规肝功能指标未明显变化，说明TBA浓度和ALT 活力无相关关系，在肝硬化后期，TBA浓度改变更 为明显，表明TBA比ALT能更敏感地反映肝硬化患 者病情。
【参考范围】 60名健康成人的空腹TBA为 4.9±2.38μmol/L,
中餐后2h TBA为 8.22±2.91μmol/L。
酶比色法测定总胆汁酸
-----临床意义
胆汁酸的生成和代谢与肝脏生理关系 密切，血清胆汁酸水平是反映肝实质损伤 的一个重要指标。血清总胆汁酸(TBA)测定 对肝病的诊断有十分重要的价值。 1．急性肝炎：急性肝炎时血清TBA显著增 高，可达正常人水平的10～100倍，甚至更 高，急性肝炎初愈患者血清TBA由最初的高 值几乎与AST在同一时间降至正常水平，若 持续不降或反而上升者则有发展为慢性的 可能。 2．慢性肝炎：慢性肝炎分为轻度、中度和 重度三个类型，空腹总胆汁酸(F-TBA)和餐 后2h总胆汁酸(P-TBA)测定对慢性肝炎的分 型、监测、预后及疗效有着重要意义。
2．自动分析法 一般无法做对照管，而是设置两 点终点法，读取前后两个吸光度A1和A2。具体按说 明书要求。
酶比色法测定总胆汁酸
【计算】 手工法：
TBA(μmol/L) =A测定-A测定对照/A标准-A标准对照×C标准
自动分析法：
TBA(μmol/L) =A测定2-A测定1/A标准2-A标准1×C标准
酶比色法测定总胆汁酸
-----临床意义
所有肝病中，餐后血清TBA水平及异常率 均比空腹时测定更灵敏，有人甚至认为餐 后测定TBA对各种肝病的诊断灵敏度和特异 性高达100%，而同时测定空腹血清胆汁酸 有40%的患者在正常范围。急性肝炎是否转 为慢性，连续监测餐后血清TBA可以观察慢 性过程，慢性活动性肝炎是否发生纤维化 改变，连续监测餐后血清TBA可以了解纤维 化过程，不做肝活检即可获得肝损伤的程 度。
酶比色法测定总胆汁酸
-----临床意义
5．中毒性肝病：在中毒性肝病时血清TBA 也将异常。 6．胆汁淤积：血清TBA测定对胆汁淤积的 诊断有较高灵敏度和特异性。肝外胆管阻 塞及肝内胆汁淤积包括急性肝炎、初期胆 管性肝硬化、新生儿胆汁淤积、妊娠性胆 汁淤积等均可引起TBA增高。在胆管阻塞的 初期，胆汁分泌减少，使血清中的TBA显著 增高，且在阻塞的不同阶段几乎保持不变； 而血清胆红素水平则随不同阶段而变化。 胆汁淤积患者肝组织中的胆汁酸含量明显 高于正常人。肝外阻塞经引流缓解后，血 清TBA水平迅速下降，而其它指标则缓慢恢 复。
2．本法灵敏度 TBA50μmol/L(标本/试剂 体积比为1：83)的样品，A410nm(1cm)为0.22左 右。Beckman DU-640分光光度计手工操作的批内 CV＜2.0%，总CV＜4.0%，日立7170自动分析仪的 批内CV＜1.5%。本法(y)与比色法(x)比较 y=0.921x–1.426，r=0.9982，n=64。本法线性上 限180μmol/L。
酶比色法测定总胆汁酸
【操作步骤】
1．手工法按表
加入物(ml) 血清 标准液 试剂Ⅰ
测定 0.1
0.3
测定对照 0.1
0.3
标准
0.1 0.3
标准对照 a
0.1 b 0.3 c
试剂Ⅱ
0.1
0.1
d
去离子水
0.1
0.1 e
混匀，37℃水浴10min，加终止液0.1ml，摇匀，
500nm波长，以水校零，读取各管A值。
酶比色法测定总胆汁酸
-----临床意义
3．肝硬化：肝硬化时，肝脏对胆汁酸的代谢能力 减低，血清TBA在肝硬化的不同阶段均增高，增高 幅度一般高于慢性活动性肝炎。即使在肝硬化晚期 亦如此。当肝病活动降至最低时，胆红素、转氨酶 及碱性磷酸酶等指标转为正常，血清TBA仍维持在 较高水平。
4．乙醇性肝病：乙醇性肝病血清TBA可增高，当乙 醇性肝病(包括肝硬化)发生严重的肝损伤时，血清 TBA明显增高，而轻、中度损伤增高不明显。有报 道认为，血清TBA测定对乙醇性肝病肝细胞损伤诊 断的可信度和灵敏度远优于各种酶学检查和半乳糖 耐量试验等指标，甚至建议将血清TBA再加上β-氨 基己糖苷酶作为乙醇性肝病的诊断指标。有人认为， 餐后60min-TBA测定对乙醇性肝病诊断更有意义。
血清总胆汁酸的检测
酶比色法测定总胆汁酸 循环法测定胆汁酸
酶比色法测定总胆汁酸
【原理】
在3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)作用下，各 种胆汁酸C3上α位的烃基(3α-OH)脱氢形成碳 基(3α=O)。同时NAD还原成NADH。随后，NADH 上的氢由黄递酶催化转移给碘化硝基四氮唑 (INT)，产生红色的甲臢。甲臢的产量与总胆 汁酸(TBA)成正比，在500nm波长比色。反应式 如下：
循环法测定胆汁酸
【计算】
TBA(μmol/L) =A测定2-A测定1/A标准2-A标准1×Cቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ准 【参考范围】
40名健康成人的空腹TBA为3.71±2.98μmol/L。
【注意事项】
血清TBA测定的酶循环法是一种通过脱氢酶辅酶体系来循环底物的方法，因此要求①这种酶 对硫代-NAD和NADH都应有高亲和力；②反应体系 的pH和缓冲液应允许正反应(底物氧化)和逆反应 (底物还原)都能进行；③还要求硫代-NAD和NADH 浓度比例合适。这些条件使反应的循环速率相当 快(约100次/min),在一定的反应时间内通过胆汁 酸的重复反应来增加硫代-NADH的量,提高反应灵 敏度。
较多研究发现：CHO、TG、Cr、UA试剂对TBA测定 有不同程度的正干扰。Cr较轻，CHO、TG较重， UA最为严重。 而且不同厂家上述项目中胆酸盐 含量也有差异。
解决自动生化分析仪试剂针携带污染所致的干扰 方法有:
①安排项目顺序时要求两个项目间至少要有一个非 干扰项目，或将被干扰项目放在干扰项目之前；
循环法测定胆汁酸
【原理】
胆汁酸被3α-羟基类固醇脱氢酶及ThioNAD+（二核苷酸氧化型）特异性地氧化，生成 3-酮类固醇及Thio-NADH（二核苷酸还原型）， 此外，生成的3-酮类固醇在3α-羟基类固醇脱 氢酶及还原性辅酶Ⅰ（NADH）存在下，生成胆 汁酸和NAD+。如此循环往复从而放大微量的胆 汁酸量，在405nm处测定生成的Thio-NADH的吸 光度变化，求得胆汁酸量。
试剂中加适量表面活性剂可防止甲 臢 沉淀。
酶比色法测定总胆汁酸（H)
【方法学评价】 1．手工法测定TBA需做标本、标准的对 照管，样品和试剂用量大，试剂价格高， 费用昂贵。分析仪测定能避免以上缺点， 但去干扰能力不如手工法分析。 血清TBA、尤其是正常血清TBA浓度低， 因而检测灵敏度至为关键，本法测定 TBA50μmol/L(标本/试剂比为1：10)的标 准液，A500nm(1cm)为0.1左右。所以低浓 度时重复性较差，对31μmol/L和 157μmol/L的样品各1份，用手工法每天上 下午双份测定，测10天，结果总CV分别为 5.46%和2.79%。。本法线性上限为 300μmol/L。
酶比色法测定总胆汁酸
-----注意事项
脂肪酶、胆固醇(包括HDL-C、LDL-C) 和甘油三酯测定试剂中均加有胆酸盐， 自动分析时会引起携带污染，必须引 起注意。某些先进的仪器可以设定试 剂针、样品针和反应杯的补充清洗程 序，亦可将TBA编排在上述有污染的项 目前测定。对某些不具备上述功能的 仪器，最好将TBA单批测定。
TBA 临床意义回顾
• 胆汁酸在肝内合成、分泌、加工、转化。当肝细 胞损伤或胆道阻塞时，会引起胆汁酸代谢障碍， 出现血清胆汁酸增高 。
• 所以测定血清中总胆汁酸可以作为判断肝胆系统 正常与否的重要信息。血清中TBA的诊断价值已得 到广泛重视，它不仅用于临床诊断，而且还能反 映病情和估计疾病预后。
临床意义简述
3α-羟基胆酸 + NAD+
NADH + H+ + INT
3-氧代胆酸 + NADH + H+
NAD+ + 甲臢 (红色)
酶比色法测定总胆汁酸
【试剂】 1．试剂Ⅰ 黄递酶 1 000U，NAD+ 1 mmol， 碘化硝基四氮唑(INT)0.5 mmol, 丙酮酸50 mmol溶于0.1mol pH 7.5 的磷酸缓冲液1 L 中，加表面活性剂适量。 2．试剂Ⅱ 3α- 羟类固醇脱氢酶(3αHSD) 2 000U溶于0.1mol pH 7.5的磷酸缓 冲液中1 L中。 3．终止液 1 mol/L HCl。 4．标准液(50μmol/L) 24.38 mg甘氨胆 酸溶于1 L经透析的混合血清中。