总胆汁酸检测ppt课件

酶比色法测定总胆汁酸
-----注意事项
由于血清中TBA含量低，样品中存在干扰物质的 影响相对就大，乳酸脱氢酶(LD)是主要的干扰物质， 由LD反应中生成的NADH往往比TBA反应中生成 的量要大得多，因此测定前去除血清中LD的影响 至关重要，方法有：血清67℃加温30min；加草 氨酸作为LD的封闭剂；碱或酸处理；用丙酮酸钠 抑制LD活性。上述5种方法中丙酮酸钠法最好，可 免去前处理步骤，直接加入反应体系，不影响体系 的pH，且对反应无干扰。 血清中还存在其它脱氢酶(有相应底物存在时)和 还原性物质，如不除去，测定结果会偏高。据无选 择的40例肝功能标本的测定结果来看，平均干扰 相当于TBA 18μmol/L，范围在5.5～45μmol/L之 间。因此自动分析设计成双试剂二步法，样品先和 不加3α -HSD的体系孵育，使样品中的干扰物质先 反应，然后再加入3α -HSD，启动TBA反应。
总胆汁酸(TBA)成正比，在500nm波长比色。
反应式如下：
3α-羟基胆酸 + NAD+
3-氧代胆酸 + NADH + H+
NADH + H+ + INT
NAD+ + 甲臢 (红色)
酶比色法测定总胆汁酸
【试剂】
1．试剂Ⅰ 黄递酶 1 000U，NAD+ 1 mmol，碘化硝基四氮唑(INT)0.5 mmol, 丙酮酸50 mmol溶于0.1mol pH 7.5 的磷 酸缓冲液1 L中，加表面活性剂适量。 2．试剂Ⅱ 3α- 羟类固醇脱氢酶(3α-HSD) 2 000U溶于0.1mol pH 7.5的磷酸缓冲液 中1 L中。 3．终止液 1 mol/L HCl。 4．标准液(50μmol/L) 24.38 mg甘氨胆酸 溶于1 L经透析的混合血清中。
试剂中加适量表面活性剂可防止甲 臢 沉淀。
酶比色法测定总胆汁酸（H)
【方法学评价】 1．手工法测定TBA需做标本、标准的对 照管，样品和试剂用量大，试剂价格高， 费用昂贵。分析仪测定能避免以上缺点， 但去干扰能力不如手工法分析。 血清TBA、尤其是正常血清TBA浓度低， 因而检测灵敏度至为关键，本法测定 TBA50μmol/L(标本/试剂比为1：10)的标 准液，A500nm(1cm)为0.1左右。所以低 浓度时重复性较差，对31μmol/L和 157μmol/L的样品各1份，用手工法每天上 下午双份测定，测10天，结果总CV分别为 5.46%和2.79%。。本法线性上限为 300μmol/L。
【参考范围】 60名健康成人的空腹TBA为 4.9±2.38μmol/L,
中餐后2h TBA为8.22±2.91μmol/L。
酶比色法测定总胆汁酸
-----临床意义
5．中毒性肝病：在中毒性肝病时血清TBA 也将异常。 6．胆汁淤积：血清TBA测定对胆汁淤积的 诊断有较高灵敏度和特异性。肝外胆管阻 塞及肝内胆汁淤积包括急性肝炎、初期胆 管性肝硬化、新生儿胆汁淤积、妊娠性胆 汁淤积等均可引起TBA增高。在胆管阻塞的 初期，胆汁分泌减少，使血清中的TBA显著 增高，且在阻塞的不同阶段几乎保持不变； 而血清胆红素水平则随不同阶段而变化。 胆汁淤积患者肝组织中的胆汁酸含量明显 高于正常人。肝外阻塞经引流缓解后，血 清TBA水平迅速下降，而其它指标则缓慢恢 复。
血清总胆汁酸的检测
酶比色法测定总胆汁酸 循环法测定胆汁酸
酶比色法测定总胆汁酸
【原理】
在3α -羟类固醇脱氢酶(3α -HSD)作用下，各种
胆汁酸C3上α 位的烃基(3α -OH)脱氢形成碳基
(3α =O)。同时NAD还原成NADH。随后，
NADH上的氢由黄递酶催化转移给碘化硝基四
氮唑(INT)，产生红色的甲臢。甲臢的产量与
酶比色法测定总胆汁酸
【操作步骤】
1．手工法按表
加入物(ml) 血清 标准液 试剂Ⅰ
测定 0.1
0.3
测定对照 0.1
0.3
标准
0.1 0.3
标准对照 a
0.1 b 0.3 c
试剂Ⅱ
0.1
0.1
d
去离子水
0.1
0.1 e
混匀，37℃水浴10min，加终止液0.1ml，摇匀，
500nm波长，以水校零，读取各管A值。
2．自动分析法 一般无法做对照管，而是设置两 点终点法，读取前后两个吸光度A1和A2。具体按 说明书要求。
酶比色法测定总胆汁酸
【计算】 手工法：
TBA(μmol/L) =A测定-A测定对照/A标准-A标准对照×C标 准
自动分析法：
TBA(μmol/L) =A测定2-A测定1/A标准2-A标准1×C标准
酶比色法测定总胆汁酸
-----注意事项
脂肪酶、胆固醇(包括HDL-C、LDLC)和甘油三酯测定试剂中均加有胆酸 盐，自动分析时会引起携带污染，必 须引起注意。某些先进的仪器可以设 定试剂针、样品针和反应杯的补充清 洗程序，亦可将TBA编排在上述有污 染的项目前测定。对某些不具备上述 功能的仪器，最好将TBA单批测定。
酶比色法测定总胆汁酸
-----临床意义
所有肝病中，餐后血清TBA水平及异常率 均比空腹时测定更灵敏，有人甚至认为餐 后测定TBA对各种肝病的诊断灵敏度和特异 性高达100%，而同时测定空腹血清胆汁酸 有40%的患者在正常范围。急性肝炎是否 转为慢性，连续监测餐后血清TBA可以观察 慢性过程，慢性活动性肝炎是否发生纤维 化改变，连续监测餐后血清TBA可以了解纤 维化过程，不做肝活检即可获得肝损伤的 程度。
循环法测定ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ汁酸
【试剂】 1．试剂Ⅰ 硫代-NAD 2mmol/L，Good’s缓冲液
200mmol/L，pH7.0。 2．试剂Ⅱ 3α-HSD 15kU/L，NADH
3mmol/L,Good’s缓冲液200mmol/L,pH8.0。 3．标准液 同比色法。 【操作步骤】自动化分析法。 • 反应类型：速率法； • 反应温度：37℃； • 波长：405nm(主)/660nm(次) • 样品3μl； • RⅠ200μl；3～5min后加RⅡ50μl, • 延迟时间1min • 读数时间4min。
循环法测定胆汁酸
【原理】
胆汁酸被3α -羟基类固醇脱氢酶及ThioNAD+（二核苷酸氧化型）特异性地氧化，生 成3-酮类固醇及Thio-NADH（二核苷酸还原 型），此外，生成的3-酮类固醇在3α -羟基类 固醇脱氢酶及还原性辅酶Ⅰ（NADH）存在下， 生成胆汁酸和NAD+。如此循环往复从而放大 微量的胆汁酸量，在405nm处测定生成的 Thio-NADH的吸光度变化，求得胆汁酸量。