促甲状腺激素(TSH)检测方法小析

促甲状腺激素(TSH)检测方法小析

摘要:促甲状腺激素(thyroid stimulating

hormone,thyrotropin,tsh)由脑垂体前叶的嗜碱性细胞分泌,以游离的形式存在于血液中,含量很低,性质稳定的一种糖蛋白激素。主要生理功能是促进甲状腺的发育和分泌,从而影响全身的代谢。鉴于tsh检测结果的重要临床意义,其检测方法有很多,主要有放射免疫分析,免疫放射分析等。随着生物、化学以及材料等学科的发展,科学家们正在努力寻求更准确、更便捷、低成本的检测方法,为内分泌疾病的临床诊断提供快速、准确的数据。

关键词:促甲状腺激素(thyroid stimulating

hormone,thyrotropin,tsh) 放射免疫分析 tsh检测方法

中图分类号:r446 文献标识码:a 文章编

号:1674-098x(2012)07(a)-0004-03

促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone,thyrotropin,tsh)由脑垂体前叶的嗜碱性细胞分泌,以游离的形式存在于血液中,含

量很低,性质稳定的一种糖蛋白激素。其相对分子量为25～28kda。与促卵泡刺激激素(follicle stimulating hormone,fsh)、促黄体生成素(luteinizing hormone,lh)以及人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hcg)一样均为异源二聚体糖蛋白激素,由非特异的α亚基和特异性β亚基以非共价键联结而成[1,2]。主要生理功能是促进甲状腺的发育和分泌,从而影响全身的代谢。

tsh是受下丘脑-脑垂体-甲状腺这一条轴线控制的,下丘脑是最

高层,分泌的促甲状腺激素释放激素(thyroid-stimulating hormone releasing hormone,trh)而甲状腺是最底层,释放的是甲状腺素,脑垂体前叶居于中间,上受到下丘脑分泌的trh调控,下有受到甲状腺分泌的甲状腺激素(t3,t4)的反馈调节。当甲状腺功能发生改变时,tsh水平呈现明显的波动。甲状腺机能低下者多表现为血液中的tsh水平增高,甲状腺功能亢进以及垂体机能减退者多表现为tsh的降低,同时tsh水平的高低也是检测新生儿先天性甲状腺机能减退的指标。1995年,美国国家临床生物化学家协会 (us national association of clinical biochemists,nacb)提出了将tsh 作为甲状腺功能的一线测试项目(first-line test)。即在甲状腺功能检测中,先考虑tsh的测试结果,再结合其余甲状腺激素的测试结果进行疾病的诊断,并且通过tsh的精确测定能排除众多非甲状腺疾病的干扰。

鉴于tsh检测结果的重要临床意义,其检测方法有很多,主要有放射免疫分析,免疫放射分析,酶联免疫吸附,时间分辨免疫荧光测定技术,电化学发光检测,化学发光免疫分析以及一些生物发光检测[3,4]、颗粒凝集检测法[5,6]等。

放射免疫分析法(radioimmunoassay,ria)是促甲状腺激素的较早期检测方法。该法使用竞争反应模式,标记tsh抗原与样本或标准品内抗原竞争结合抗体,实现定量。放射免疫分析灵敏度不够,无法区分部分正常人的tsh水平,且操作时间很长,干扰因素多、放射性元素的抗原标记物稳定性欠佳,故其应用受到一定的限制[7]。免

疫放射分析(immunoradiom-eric assay,irma)在ria基础上进行改进,该方法使用过量标记抗体,采用双抗体夹心的免疫反应模式。一方面保证抗体与待测标本中的抗原充分反应,缩短反应时间,一定

程度上提高了灵敏度;另一方面,标记的是免疫球蛋白,标记试剂相对稳定。但其仍无法避免方法的放射性元素的污染[8～12]。

继放射免疫分析后出现的tsh酶联免疫吸附法(immunoenzymetric assay,iema)或称之为酶联免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay,elisa)以酶作为标记物,使用非竞争反应模式,通过酶催化底物显色。tseng 等使用碱性磷酸酶作为抗体的标记物,用抗-tsh多抗包被96-孔酶标板,利用碱性磷酸酶对底物对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-npp)作用,生成黄色对硝基苯酚在405nm处产生吸收,实现对tsh的检测。该法虽避免放射性元素的污染,较ria反应时间有所缩短,但由于使用分光光度法检测,灵敏度欠佳[13,14]。

随着生物技术的发展,可以获得识别两种抗原(tsh和碱性磷酸酶)的双特异抗体。morimoto等通过该双特异抗体的f(ab’)片段包被固相,酶通过免疫反应与标记抗体相联,极大减小了蛋白的干扰,使得检测灵敏度得到一定的提高[15]。

八十年代发展的时间分辨免疫荧光测定技术(time resolve immunofluorometric assay,trifma)具有量子产率高,stoke’s位移大,发射峰窄等优点。它属于超微量免疫分析技术。该技术使用镧系元素[16,17]为示踪剂代替放射性同位素,用具有双功能基团

的镧系元素来标记抗原或抗体,当解离下来的镧系元素与特制的扩增液形成新的螯合物时,其荧光明显增强而持久。90年

代,papanastasion diamandi等[18]通过生物素-亲和素作用力将碱性磷酸酶与抗体相连接,碱性磷酸酶作用于底物,5-氟水杨酸磷酸

酯(5-fluorosalicyl phosphate,5-fsap),生成产物5-氟水杨酸(5-fluorosalicylic acid,5-fsa)。加入铽(tb3+)-乙二胺四乙酸(edta)螯合物后形成荧光寿命长三元复合物fsa-tb3+-edta。为了满足临床快速检测,ylikotila等[19]通过生物素-亲和素之间的作用,将特异性优异的生物素化重组fab’片段与固相上的亲和素作用,减小抗体的表面积(至一斑点大小),利用高灵敏的时间分辨荧光检测,效果良好。

tsh的电化学发光检测中,常用的体系为三联吡啶钌

[ru(bpy)3]2+-三丙胺氨系统[20]。加拿大的elecsyst 2010免疫分析[21,22]使用链亲和素包被的磁性微粒子,通过亲和素与生物

素化抗体的相互作用,实现结合物与游离物质的分离。

化学发光测定技术按照标记方法的不同分为化学发光金标记免

疫分析法和以酶标记的化学发光酶免疫分析方法。化学发光免疫分析法将发光物质如吖啶酯类化合物(如吖啶酯[23～28],吖啶盐的

琥珀酰亚胺衍生物(n-succinimidyl derivative of an acridium salt)[29],异鲁米诺等直接标记在抗原或抗体上的化学发光免疫

分析法,因发光时间短,需要高精度自动分析系统。

化学发光酶免疫分析,以酶标记tsh抗原或抗体,进行免疫反应,