流式细胞术原理及应用

流式细胞术原理及应用
流式细胞术原理及应用
基本原理
特定波长的激光束直接照射到高压驱动的液流，产生的 光信号（散射光信号和荧光信号）被多个接收器接受，根据 信号的强弱波动就能反映出每个细胞的物理化学特征。 ·流式细胞仪 ·细胞样品 ·荧光染料或者荧光素偶联抗体
流式细胞术原理及应用
流式细胞仪
1. 液流系统
2. 光路系统
3. 检测分析系统 4. 分选系统
流式细胞术原理及应用
散射光信号
前向角散射光（FS, Forward Scatter） 在光束正前方检测，前向散射光的强度与细胞或颗粒 的大小有关
侧向角散射光（SS, Side Scatter） 与光束垂直方向检测，侧向散射光的强度与细胞内颗 粒结构复杂程度有关
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前向散射光（FSC）
White Light Source Transmitted Light
620 -640 nm Light
Dichroic Filter/Mirror at 45 deg Light Source Transmitted Light
Reflected light
光路系统就是利用滤光片的不同组合达到分离光信号的目的。
二向色性滤片( dichroic filter)
当以 45o 角放置滤片时,该滤片可以通过一定波长的光,同时也可以阻 断并折射该波长以外的光
光路系统就是利用滤光片的不同组合达到分离光信号的目的。
流式细胞术原理及应用
带通滤片(band pass filter)
630 nm Band Pass Filter
SSC和荧光
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3. 检测分析系统
光电倍增管(Photomultiplier tube, PMT)
流式细胞术原理及应用 通道 (channel)
流式细胞术原理及应用
+
4. 分选系统
+ ++ + + -----
+++++++++
--------++ ++
++
+
+ + + + +
分选系统分选原理示意图
免疫荧光
免疫荧光 DNA染色 免疫荧光
橙红
红 橙红 深红
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Wavelength
400 nm 500 nm 600 nm 700 nm
Relative Intensity
激发 发射
异硫氰酸荧光素 (FITC)
流式细胞术原理及应用
Wavelength Relative Intensity
流式细胞术原理及应用
Principle and Application of Flow Cytometry
Fu Fenfen
流式细胞术原理及应用
流式细胞术
流式细胞仪的出现和流式细胞术的发展是多学科领域共同发展 的结晶，其中涉及细胞细胞生物学、分子生物学、分子免疫学、单克隆 抗体技术、激光技术、荧光化学、光电子物理、流体力学、计算机技术 等。 流式细胞术用于主要用于生命科学的基础研究，尤其是免疫学、 细胞生物学、肿瘤学。从80年代后期开始应用于临床，流式细胞术能辅 助多种疾病的诊断，尤其是白血病的诊断和分型。此外，利用流式分选 干细胞过继回输可用于疾病的治疗。
流式细胞术原理及应用
流式细胞术的应用
科研应用：
细胞表面分子 细胞内或细胞核内抗原 细胞核酸 细胞凋亡 细胞增殖 细胞融合 细胞毒 胞内活性氧水平 细胞膜电位 细胞内钙离子浓度 干细胞（SP） 荧光蛋白表达 ……
临床应用：
HIV免疫分型，CD4绝对计数 白血病和淋巴瘤的免疫分型 肿瘤细胞的周期和倍体分析 网织红细胞和网织血小板计数 移植前的交叉配型和免疫状态监测 干细胞计数 微量残留白血病细胞检查 HLA-B27检查 血小板功能及相关疾病 ……
流式细胞术原理及应用
百度文库常用荧光染料的特性
荧光染料 FITC PE(RD1)
激发波长 (nm) 488 488
发射波长(nm) 525 575
用途 免疫荧光 免疫荧光
颜色 绿色 橙色
ECD
PeCy5 PI PECy7 PerCP APC
488
488 488 488 488 633
620
675 620 755 670 670
400 nm 500 nm 600 nm 700 nm
Excitation Emission
藻红蛋白 (PE)
流式细胞术原理及应用
5 Color Single Laser (488nm) FITC/PE/ECD/PC5/PC7
流式细胞术原理及应用
滤光片
1. 长通滤片(long pass filter)：波长大于特定波长的光可以通过，小 于该波长的光被反射； 2. 短通滤片(lshort pass filter)：波长小于特定波长的光可以通过， 大于该波长的光被反射； 3. 带通滤片(band pass filter)：波长在特定范围的光可以通过，该范 围以外的光被反射；
Laser
Detector
Laser
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侧向散射光（SSC）
流式细胞术原理及应用
外周全血细胞散射光双参数点图 （红细胞溶解后）
流式细胞术原理及应用
荧光信号
每种荧光染料均有特定的激发波长, 并激发后会有发射 波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长.
利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这些光学信号.
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流式图
流式直方图
Cell cycle analysis
Immunophenotyping
15
11
0
Count
7
3
0
0
0
0
.1
1
10
100
1000
Log FITC
流式细胞术原理及应用 流式散点图
流式细胞术原理及应用
CST #5616 (Alexa Fluor® 488 Conjugate) : Jurkat (blue) and HeLa (green)
流式细胞术原理及应用
1. 液流系统
喷嘴 样品管
鞘液桶
Injector Tip
废液桶
光源
散射光信号 荧光信号
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2. 光路系统
光源 激光器：常用的有 488nm blue, 635nm red, 355nm UV, 514nm green 激光器 488nm blue 635nm red 355nm UV 常用通道分配 FSC, SCC, FITC, PE, PE-TexRed, PE-Cy5, PE-Cy7 APC, APC-Cy7 Hoechst, DAPI
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PE-TxRed 488激光侧面接收光光信号分离示意图 670/30nm带通 655-685nm PE-Cy5
615-645nm
630/30nm带通
650短通
740长通
>740nm PE-Cy7 580/30nm带通 565-595nm PE 605短通 510-550nm FITC 530/40nm带通 505短通 488/10nm带通 SSC 483-493nm 555长通 718短通