免疫组织化学技术(ABC法)

免疫组织化学技术（ABCxx）

大鼠脊髓冰冻切片或细胞爬片依次入含3%Triton-x100和

0.03%H

2O

2的

0.01%磷酸盐缓冲液(PBS, pH

7.4 )，室温30min；含3%牛血清白蛋白(BSA, Sigma)的PBS，室温30 min；豚鼠抗HAP1抗体（1:300），4℃孵育48h；PBS漂洗3次，每次10min；生物素化羊抗豚鼠IgG（1:200）室温2小时；PBS漂洗3次，每次10min；ABC复合物(1:100)，2小时；PBS漂洗3次，每次10min；含

0.03%DAB和

0.006%H

2O

2的Tris盐酸缓冲液（pH

7.6）室温13min；常规脱水、透明、树脂封片，显微镜观察、拍照。以上免疫染色以PBS缓冲液替代一抗作阴性对照。

鞘内注射HAP1-siRNA后大鼠脊髓HAP1表达水平的变化。A示对照组大鼠脊髓背角HAP1免疫反应性，B示RNAi组大鼠脊髓背角HAP1免疫反应性强度减弱。C示RNAi后大鼠脊髓HAP1表达水平的免疫印迹检测。D示RNAi后大鼠脊髓背角免疫反应强度变化的统计学分析，*示与对照组比较，P<

0.01。比例尺为100μm。E示RNAi后大鼠脊髓HAP1蛋白含量变化的统计学分析，▲示与对照组比较，P<

0.01。

免疫荧光双标技术

脊髓切片或生长在盖玻片上的PC12细胞依次入含3%Triton-100的PBS，室温30min，含2%正常羊血清(NGS)和3%BSA的PBS，室温30min，入豚鼠抗HAP1抗体(1:3000)和兔抗NK1R(1:100)，4℃孵育48h；PBS漂洗3次，每次10 min，加入RodamineRed或FITC标记的驴抗豚鼠或兔IgG（1:500），室温闭光2h，PBS闭光漂洗3次，每次10min，含10%甘油的PBS封片。荧光显微镜观察，FITC用488nm氩氪激光激发，用530-560nm滤光片检测；Rodamine Red用543nm氩氪激光激发，用570nm滤光片检测。

HAP1和NK1R在大鼠脊髓背角中的定位关系。A示荧光标记的脊髓灰质背角浅层表达的HAP1，B示荧光标记的脊髓灰质背角浅层表达的NK1R，C示A和B的重叠图像。箭头示HAP1和NK1R双标细胞。

比例尺为20μm。

细胞进行处理后，弃培养基，用

0.01MPBS漂洗3遍。加入4%多聚甲醛固定30min。PBS漂洗3遍。

加入3%Triton-x 100的PBS，室温30 min；含2%正常驴血清(NGS)和3%BSA 的PBS，室温30 min；分别加入小鼠抗MAP2单克隆抗体(1:200，Neuro-Marker 公司)或兔抗mGluR5多克隆抗体（1:1000，sigma公司）或兔抗NSE多克隆抗体（1：100，北京中山生物技术公司）4℃孵育48h；PBS漂洗3次，每次

10min；入Rodamine Red标记的驴抗兔/小鼠IgG（1:500，Jackson ImmunoResearch Laboratories），室温闭光3h；PBS闭光漂洗3次，每次10 min；含10%甘油的PBS封片。激光共聚焦显微镜（Olympus FV500）观察，EGFP用488nm氩氪激光激发，用530-560nm滤光片检测；RodamineRed用543nm氩氪激光激发，用570nm滤光片检测。