噬菌体

(2)裂解期（risephase） 裂解期（ 裂解期 ） 紧接在潜伏期后的一段宿主细胞迅速裂解、 溶液中噬菌体粒子急剧增多的一段时间。 噬菌体的裂解量一般为几十到上百个，植 物病毒和动物病毒可达数百乃至上万个
(3)平稳期（plateau） 平稳期（ 平稳期 ） 指感染后的宿主已全部裂解，溶液中噬菌 体效价达到最高点后的时期。 病毒的特点：对宿主具严格专一性，只能 病毒的特点 在活细胞内繁殖。
噬菌体
噬菌体种类
主要为六种主要形态 ①A型，dsDNA，蝌蚪状，收缩性尾 ②B型，dsDNA，蝌蚪状，非收缩性尾 ③C型，dsDNA，非收缩性尾 ④D型，ssDNA，球状，无尾，大顶衣壳粒 ⑤E型，ssRNA，球状，无尾，小顶衣壳粒 ⑥F型，ssDNA，丝状，五头尾
噬菌体构造
1.噬菌体的繁殖
四类病毒及其繁殖方式
原核生物病毒 植物病毒 人类和脊椎病毒 昆虫病毒
噬菌体
噬菌体（phage,bacteriophage）即原核生物 噬菌体 的病毒，包括噬细菌体 噬细菌体（bacteriophage）,噬 噬细菌体 噬 放线菌体（actinophage)噬蓝细菌体 放线菌体 噬蓝细菌体 (cyanophage)等。在自然界中分布广泛，有 原核有原核生物的地方就有相应的噬菌体。
★烈性噬菌体与温和噬菌体的生活史比较： 烈性噬菌体与温和噬菌体的生活史比较：
吸 附 侵 入 性恞 增 殖 成 熟 裂 解
⑤
恞 整 合 同 步 复 制 性恞 自 发 或 诱 导
温和噬菌体与溶源性
★温和噬菌体 温和噬菌体(temperate phage)----吸附并侵入细 吸附并侵入细 温和噬菌体 胞后，噬菌体的DNA整合在宿主的染色体组上，并 整合在宿主的染色体组上， 胞后，噬菌体的 整合在宿主的染色体组上 可长期随宿主DNA的复制而同步复制，因而在一般 的复制而同步复制， 可长期随宿主 的复制而同步复制 情况下不进行增殖和引起宿主细胞裂解的噬菌体, 情况下不进行增殖和引起宿主细胞裂解的噬菌体 如E.coli的 λ 、P1、P2，Salmonella 的 、 ， typhimurium的P22等。 的 等 ★原(前)噬菌体 前 噬菌体(prophage)----处于整合态的噬菌体 处于整合态的噬菌体 噬菌体 核酸。 核酸。 温和噬菌体的特点——1.其核酸的类型都是 ★温和噬菌体的特点 其核酸的类型都是 dsDNA; 2.具有整合能力；3.具有同步复制能力。 具有整合能力； 具有同步复制能力 具有同步复制能力。 具有整合能力
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侵入
通过尾部刺突固着于细胞； 尾部的酶水解细胞壁的肽聚糖，是细胞壁产生小孔； 尾鞘收缩，核酸通过中空的尾管压入胞内，蛋白质外壳留在 胞外；
增殖阶段：
噬菌体DNA进入细菌细胞 后，会引起一系列的变化： 细菌的DNA合成停止，酶 的合成也受到阻抑，噬菌体 逐渐控制了细胞的代谢。噬 菌体巧妙地利用寄主(细菌) 细胞的“机器”，大量地复 制子代噬菌体的DNA和蛋 白质，并形成完整的噬菌体 颗粒。噬菌体的形成是借助 于细菌细胞的代谢机构，由 本身的核酸物质操纵的。
溶源菌的识别
检验某菌株是否为溶源菌的方法， 是将少量溶源菌与大量的敏感性 指示菌相混合，然后与上层琼脂 培养基混匀后倒平板，经培养后 溶源菌就一一长成菌落。由于溶 源菌在细胞分裂过程中有极少数 个体会引起自发裂解，其释放的 噬菌体可不断侵染溶源菌菌落周 围的指示菌菌苔，于是就形成了 一个个中央有溶源菌的小菌落， 四周有透明圈围着的这种独特噬 菌斑。
噬菌体效价测定法
一. 点滴法 1. 将指定之寄主细菌以液体培养法于适当温度下培养，一般培养16~24 小时。 2. 取300 µl 寄主细菌悬浮液加入5 ml 冷却至45℃的0.7﹪琼脂培养基中， 均匀混合后立即平铺于已凝固的1.8﹪琼脂培养基上，并静置30分钟以上 使其凝固。 3. 以1% peptone为稀释液，将噬菌体原液做10倍序列稀释，一般稀释至 107倍即可。 4. 将平板划分为八个区域，以pipetman取不同稀释倍数之噬菌体稀释液 各 1 µl，分别接种于不同的区域上。 5. 将平板置于适合的温度下，一般培养8~24小时，待溶菌斑产生后观察 并计算其数目。一般噬菌体浓度太高的区域会融合成一个大的溶菌斑， 而浓度适中的区域会形成肉眼可观察的溶菌斑。 6. 噬菌体效价 (pfu/ml)＝溶菌斑数×稀释倍数×取样量折算数
一步生长曲线
100 Plaque number One-step grow th curve Grow th curve in host bacteria
一步生长曲线
10 Latent phase 1 Eclipse phase 40 Rise phase Plateau phase
10 Fig.
噬菌体效价的测定
在菌苔上形成一个具有一定形状、大小、 边缘和透明度的负菌落称噬菌斑。可用作噬 菌体的鉴定指标，也可用于纯种分离和计数。
效价(滴度 是微生物或其产物、 效价 滴度Title)-------是微生物或其产物、抗原 滴度 是微生物或其产物 高低的标志。 与抗体等活性 高低的标志。 噬菌体效价--------指噬菌体的浓度，即每毫升 指噬菌体的浓度， 噬菌体效价 指噬菌体的浓度 样品含噬菌体的个数。 样品含噬菌体的个数。通常是在含敏感菌的 平板上形成噬菌斑进行噬菌体的计数 上形成噬菌斑进行噬菌体的计数， 平板上形成噬菌斑进行噬菌体的计数，以每 毫升中含有的噬菌斑形成单位（ 毫升中含有的噬菌斑形成单位（plaque forming unit/ml或pfu/ml)表示其效价。 表示其效价。 或 表示其效价
据观察，当噬菌体侵入细菌 细胞后，细菌的细胞质里很 快便充满了DNA细丝，十 分左右开始出现完整的多角 形头部结构。噬菌体成熟时， 这些DNA高分子聚缩成多 角体，头部蛋白质通过排列 和结晶过程，把多角形 DNA聚缩体包围，然后头 部和尾部相互吻合，组装成 一个完整的子代噬菌体。
成熟阶段
噬菌体成熟后，在潜伏后期， 溶解寄主细胞壁的溶菌酶逐 渐增加，促使细胞裂解，从 而释放出子代噬菌体。在光 学显微镜下观察培养的感染 细胞，可以直接看到细胞的 裂解现象。T2噬菌体在37 ℃下大约只需四十分就可以 产生100～300个子代噬菌 体。子代噬菌体释放出来后， 又去侵染邻近的细菌细胞， 产生子二代噬菌体。
潜伏期（ 潜伏期（latent phase) 裂解 期（rise phasse） ） 平稳期(plateau phase) 平稳期 裂解量(Burst phase) 裂解量
(1)潜伏期（latentphase） 潜伏期（ 潜伏期 ） 指噬菌体的核酸侵入宿主细胞后至第一个噬菌体 粒子装配前的一段时间，故整段潜伏期中没有一个 成熟的噬菌体粒子从细胞中释放出来。 不同病毒的潜伏期长短不同，噬菌体以分钟计， 动物病毒和植物病毒以小时或天计。
溶源菌有以下特性： ⑦溶源菌有以下特性：
☆可稳定遗传，即溶源菌的子细胞一般也是溶原性的。 可稳定遗传，即溶源菌的子细胞一般也是溶原性的。 自发裂解和诱发裂解（具有产生噬菌体的潜在能力） ☆自发裂解和诱发裂解（具有产生噬菌体的潜在能力） 具有抗同原噬菌体感染的“免疫性” ☆具有抗同原噬菌体感染的“免疫性” ☆溶源性细菌的复愈 ☆获得新的生理特性（溶源性转变） 获得新的生理特性（溶源性转变） ☆局限性转导
20
30
Time(min)
One-step grow th curve of T 2
一步生长曲线的实验步骤：
a.用噬菌体的稀释液感染高浓度的宿主细胞； b.数分钟后，加入抗噬菌体的抗血清（中和未吸附的噬菌体）； c.将上述混合物大量稀释，终止抗血清的作用和防止新释放的噬菌体感 染其它细胞； d.保温培养并定期检测培养物中的噬菌体效价（对噬菌体含量进行计 数）； f.以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标，绘制出病毒特征性的 繁殖曲线；
释放
众多的溶菌酶，最终因外在的原因而导致细胞破裂的现象称 之为自外裂解（Lysis from without）。 自外裂解是不能产生子代噬菌体的裂解方式。 平均每一个宿主细胞裂解后所产生的子代噬菌体数称作裂解 量（burst size）。 丝状噬菌体（如M13或fd）不杀死细胞，子代毒粒以分泌 方式不断从受染细胞中释放，并同时完成毒 粒的组装
★温和噬菌体在细菌染色体上的整合位置： 温和噬菌体在细菌染色体上的整合位置 就目前所知，所有温和噬菌体的核酸都是双链DNA。 就目前所知，所有温和噬菌体的核酸都是双链 。 按照温和噬菌体DNA与细菌 与细菌DNA结合部位的不同，又可将 结合部位的不同， 按照温和噬菌体 与细菌 结合部位的不同 其分成两类： 其分成两类： 只有一个特定结合部位的温和噬菌体： ①只有一个特定结合部位的温和噬菌体： 如： 大肠杆菌的 λ 噬菌体 具有多个或不定部位的温和噬菌体： ②具有多个或不定部位的温和噬菌体： 大肠杆菌的P1噬菌体 如： 大肠杆菌的 噬菌体 鼠伤寒沙门氏菌 P22 噬 菌体 。
噬菌体效价测定法
二. 双层琼脂培养法 1. 将指定之寄主细菌以液体培养法于适当温度下培养，一般培养16~24 小时。 2. 以1% peptone为稀释液，将噬菌体原液做10倍序列稀释，一般稀释至 107倍即可。 3. 取噬菌体稀释液100 µl 与寄主菌液300 µl均匀混合，静置15分钟使其 感染。 4. 将上述混合液加入5 ml 冷却至45℃的0.7﹪琼脂培养基中，均匀混合 后立即平铺于已凝固的1.8﹪琼脂培养基上。 5. 将平板置于适合的温度下，一般培养8~24小时，待溶菌斑产生后观察 并计算其数目。 6. 噬菌体效价 (pfu/ml)＝溶菌斑数 ×稀释倍数 ×取样量折算数
4.溶源性（lysogeny） 溶源性（ 溶源性 ） 温和噬菌体侵入相应宿主细胞后，噬菌体 DNA 整合到宿主的基因组上，并随宿主的复 制而进行 同步复制，温和噬菌体侵入并不引起宿主细 胞裂解的现象溶源性或溶源现象。
溶源性
（2）溶源菌的显著特性 ①溶原性是溶源菌的一个极稳定的遗传特性 ②自发裂解（spontaneous lysis） ③ 诱导（induction） ④ 免疫性（immunity） ⑤ 复愈 ⑥ 溶源转变（lysogenic conversion）
吸附
吸附于大肠杆菌上的噬菌体
吸附于大肠杆菌性毛上的噬菌体
(2)侵入（penetration） 侵入（ 侵入 ）
侵入又称病毒内化，它是一个病毒吸附后几乎立即发生，依 赖于能量。 不同的病毒-宿主系统的病毒侵入机制不同。 T4通过尾丝吸附于宿主E.coli 表面。吸附后，由于基板受 到构象上的刺激，中央 孔开口，释放溶菌酶并水解部分细胞壁，接着尾鞘蛋白收缩， 把尾管插入宿主细胞中。
一个典型的噬菌体的 侵染细菌的过程，可以 分为三个阶段：感染阶 段、增殖阶段和成熟阶 段。
感染阶段
噬菌体侵染寄主细胞的第一步 是“吸附”，即噬菌体的尾部 附着在细菌的细胞壁上，然后 进行“侵入”。噬菌体先通过 溶菌酶的作用在细菌的细胞壁 上打开一个缺口，尾鞘像肌动 球蛋白的作用一样收缩，露出 尾轴，伸入细胞壁内，如同注 射器的注射动作，噬菌体只把 头部的DNA注入细菌的细胞内， 其蛋白质外壳留在壁外，不参 与增殖过程。