甲基化实验方法和步骤

实战经验：
甲基化检测方法总结——（亚硫酸氢盐修饰后测序法）
第一部分基因组DNA的提取
这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。

DNA 比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。

此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。

因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。

使用两者的细节：
1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；
2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。

否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。

两者均于-20度保存。

验证提取DNA的纯度的方法有二：
1：紫外分光光度计计算OD比值；
2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。

我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA 的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。

第一天只需下午半天即可
下午3点开始，先配好试剂再开始做实验
需提前消毒的物品：1.5mlEP管一大盒，双蒸水200ml，15ml
离心管，开水浴锅，
第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA
如不特别指出，所用双蒸水均经高压蒸汽灭菌。

1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用双蒸水稀释至45ul【20ulDNA+25ul双蒸水】；2：加5ul新鲜配制的3M NaOH【0.12g定容到1ml，用1.5mlEP管配制】；
3： 42℃水浴30min；水浴完后把水浴锅调至50℃
水浴期间配制： 4：20mM对苯二酚氢醌【0.022g氢醌定容至10ml，用15ml离心管配】，加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）
5： 3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：用15ml离心管配，1.88 g 亚硫酸氢钠使用3ml 双蒸水稀释，【一次性加350ul 3M NaOH，，然后谨慎每次加入10ul 3M NaOH仔细观察】并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。

这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。

PH 一定要准确为5.0。

加520ul至上述水浴后溶液中。

6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。

8：用浮漂固定EP管50℃避光水浴16h。

一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am 以后收，时间上很合适。

这一步细节：
1)基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有
丢失，且此方法修饰最多可至4ug。

2)所有试剂均须新鲜配制，所以配液的技术要过关，既要快，又要精确。

3)亚硫酸氢钠溶液呈强酸性，一定用碱将PH调制5.0，否则PH不合适会影响
后续纯化吸收。

4)水浴最好达16小时，虽可以短至8小时，但后者修饰会有不完全。

第二天只需要上午半天即可
上午8点开始配试剂：开水浴锅70℃
4ml 冰无水乙醇放于-20℃【4ml EP管配制】
配制10ml 80%异丙醇【15ml离心管配制】
5ml注射器2个
10M 乙酸铵【用4ml EP管配制，0.778g乙酸铵定容至1ml】
3M NaOH【0.12g定容到1ml，用1.5mlEP管配制】；
上述溶液配制完后将双蒸水放于水浴锅内
第三部分修饰后DNA纯化回收
2：以下使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统（Promega，A7280）
1）70℃水浴预热DDW；配制80%异丙醇；
2）加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin【用之前一定记得摇摇树脂瓶子，混匀树脂】，轻柔颠倒混匀，使DNA充分与树脂结合；
3）由于该试剂盒中仅配备针筒没有针栓，自备5ml注射器。

将注射器针筒【切记拔掉针栓后再连接】与试剂盒提供的回收小柱【在回收小柱上做标记】紧密连接后，将上述混合物用移液器移至针筒内，用4ml EP管放置小柱下接收废液。

加针栓，轻轻加压，将液体挤出，此时可见小柱内有白色的树脂沉积。

4）将注射器与小柱分离后拔出针栓，再将针筒与小柱连接，向针筒内加入2ml 80％的异丙醇，插入针栓，轻轻加压，将异丙醇挤出。

此为洗涤步骤。

此步骤操作2次。

5）将注射器与小柱分离，将小柱置于洁净1.5ml洁净EP管上，盖紧盖子，离心12000rpm，2min，以甩去残余异丙醇成分，使树脂干燥。

此时，修饰后DNA处于与树脂结合状态。

6）将小柱取下置于另一洁净1.5mlEP管上，移液器加45ul【分2次加2次离心，第一次加25ul离心，第二次加20ul离心】预热好的DDW，室温放置5min。

7）离心12000rpm，20s，此为洗脱步骤，此时EP管内液体即为洗脱的修饰后DNA溶液，终体积为45ul。

3：加5ul 新鲜配制的3M NaOH，室温放置15min。

4：加33ul 10M乙酸铵，以中和NaOH，使溶液PH于7.0左右。

5：加2ul 20mg/ml糖原，此作为沉淀指示剂，因为其与乙醇混合后可产生沉淀，便于以后
离心后辨别回收物的位置，以防在吸取残余乙醇时将回收物吸走。

6：加270ul 冰无水乙醇，置于-80度，过夜沉淀。

第二天中午11:30分左右即可完成！
此步细节：
1)在使用注射器时，一定要用力均匀且轻，如使用暴力，会将小柱内的薄膜挤破，失去作
用。

2)乙酸铵、糖原不需新鲜配制，糖原配好后放在-20度保存，乙酸铵室温即可，因为这样
浓度的乙酸铵非常难溶，一旦放在4度，取出用时也会有很多溶质析出。

3)异丙醇、70%乙醇都不需要新鲜配制，但如果用量大，现场配也很方便。

此步关键是在树脂与DNA的结合上，这就再次强调第二部分调亚硫酸钠PH值得重要性。

因为树脂与DNA结合需要有一个适当的PH，如前一步没做好，此步树脂不能与DNA很好结合，将会带来灾难性后果，即DNA随着液体被挤出了，洗脱时实际已没有任何DNA了。

第三天满满一整天【DNA回收+PCR+ PCR产物的凝胶回收】
上午：开4℃离心机，配制70%乙醇
7：4℃，12000rpm离心，30min，倒去上清液，收集沉淀。

不必吸净。

8：加500ul 70%乙醇，不要将沉淀吹打起来，只要把乙醇加上即可。

轻柔倾斜EP管，旋转一圈，再次离心，4度12000rpm，5min。

离心后倒掉上清，再加同量乙醇，同样再做一遍。

此为洗涤步骤，共2次。

9：倒掉上清，并常温简短离心后，将附壁乙醇离至EP管底，移液器小心将残余液体吸净，室温干燥5min，或沉淀由不透明变为半透明或透明时，加入20ul-30ul 双蒸水，溶解沉淀。

至此，已完成了修饰后DNA的纯化回收，所得为修饰后DNA溶液，可用于此后的进一步实验。

10：-20℃保存DNA溶液。

第四部分修饰后DNA用于PCR
青年P 2管，老年P 2管，保证DNA量足够。

PCR反应条件12026，PCR产物20ul全部上样。

配制1.5%的胶，胶要薄一点，胶厚了不好回收。

反应体系：DNA 2ul
上引0.5ul
下引0.5ul
Mix 10ul（要用高保真的Taq酶，防止碱基错配）
双蒸水7ul
这一步也没有悬念。

我主要谈一下这里面的几个比较棘手的问题：
1：引物问题：我感觉自己设计引物有相当的难度，我曾设计过几对引物，并且试验了一下，但以失败告终。

如果时间充裕、作的又是比较新的基因文献不多，自己设计引物没有问题。

如果不是这样，还是参考文献更好些。

首先查阅SCI分值高的文献，然后是著名实验室的文献，如果国内有做的，更好了，可以直接联系咨询。

查到序列后，一定要和Genbank中的序列进行比对，防止有印刷错误造成的个别碱基的差别。

然后再到google上搜一下，看用的人多否，体系条件是否一样。

用的人多、体系条件一样，表明可重复性比较强。

我也是按
此行事，算比较顺利。

2：Taq酶问题：有文献用高保真的金牌Taq（Platinum），但我感觉只要体系正确、变性退火等条件合适，一般的热启动酶是可以的。

我开始使用的是Takara的LA Taq，很好用，配有10x含mg++的LA缓冲液。

有时候用没了，暂时以Takara 的普通Taq酶也可以。

如何选择，可以根据自己的情况。

初作者还是用好一点的酶。

3：PCR的条件：变性一般都选择95度，3min。

其余我感觉还是根据文献，退火可以根据你的引物的退火温度在小范围内尝试。

一般和文献报道差别不大。

只是扩增片断特异性的问题。

建议根据文献。

4：做PCR的EP管最好选择进口的，壁薄且厚度均匀，这可以保证温度的迅速变化可以及时传递给管内的反应液，使体系真正在所设定的温度下运行。

5：PCR仪：如果在某一个仪器上作出来了，最好一直用此仪器继续。

不同的仪器“脾气”也不一样，但EP管必要和仪器内的插孔紧密结合方好，留有空隙，我认为会影响温度的传递。

第五部分PCR产物的凝胶回收
把切下来的胶按试剂盒说明书操作即可。

几个细节：
1：PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，要使用新配的电泳液。

凝胶浓度1%-2%均可。

2：凝胶DNA回收时在300nm紫外灯下观察条带位置，切取目的片断所在位置的凝胶，尽量小，保证特异性。

3：紫外照射时间不能过长，否则对DNA有损伤。

4：回收后的DNA如不马上用就储存于-20度，在数月内是很稳定的。

第四天半天即可，下午开始
前一日消毒物品：1ml、200ul、20ul枪头、15ml离心管、1.5ml EP管100ml LB液体培养基、200ml LB固体培养基【切记！！消毒完后立即放入65℃烤箱内，LB培养基瓶口用锡箔纸包住后再用包布包住】
TRYPTONE 1g
LB液体培养基Yeast Extract 0.5g 双蒸水定容至100ml
Nacl 1g
TRYPTONE 2g
LB固体培养基Yeast Extract 1g 双蒸水定容至200ml
Nacl 2g 可以倒8块板子
Agar 3g
准备物品：拿培养皿，照台子，LB固体培养基倒板子【切记！！倒之前待200ml LB固体培养基冷却至37℃时加入200ul AMP，倒的过程中不要挪动皿，不用的板子封口膜封住4℃倒置放】、打冰放入4℃冰箱
第六部分PCR产物与T载体的连接和转化、白斑筛选
1：连接T载体参照试剂盒
（1）T—Vector PMD19（simple）1ul【已分装好，将PCR产物直接加进去】回收的PCR产物4ul
（2）将上述5ul溶液加入到5ul solution【已分装好】里面，充分混匀。

（3）PCR仪里面16℃孵育30分钟—1小时。

（4）将上述10ul反应溶液加入含有100ul感受态细胞的1.5mlEP管内【切记！！感受态细胞不能离心,感受态细胞要放在冰上】，轻弹管壁混匀，冰浴30min【提前打好冰放4℃冰箱】。

（5）42℃热休克45second【接杯水用温度计调整温度为42℃】，然后迅速放到冰上冰浴1min。

（6）加入不含AMP的LB液体培养基890ul【切记！！不含AMP】，水平放置EP管，37℃摇床，200转，摇1小时。

（7）将EP管拿出离心2000rpm【转速要准确】，1min，超净台内稍微去上清，留100—150ul。

（8）涂板：涂板后先正置30min【防止液体倒流】，再将板子倒置37度细菌培养箱过夜；（板为含有氨苄青霉素的固体LB培养基）涂板过程中要注意用酒精消毒，防止细菌交叉污染！
第五天上午
（1）过夜后可见板上长出很多白色斑点，用20ul枪头挑取单个的白色斑点放于15ml离心管内【离心管内装有5-6ml 的！！加入AMP 的LB液体培养基】，离心管的盖子不能盖紧【保证氧气进入】！
（2）将15ml离心管斜放入杯子内37度，200转，摇床过夜。

第六天一整天
（1）早上看到菌液浑浊后，吸取2ul菌液行PCR跑胶鉴定，剩余的菌液盖子拧紧4℃保存
【防止细菌长老了】。

如果当天不能测序的话可以等到晚上取100ul
菌液再次摇过夜第二日送检。

（2）联系测序公司送测序。

这一部分的细节：
不要让白斑长得太满，否则选取克隆时容易一下挑2个。

注意事项：
1.整个操作中不要有剧烈的振荡（也就是在加入各种液体混匀的过程中）。

因为经过氢氧
化钠处理后的DNA相对比较脆弱，剧烈的振荡（vortex）可能会造成DNA的断裂，如果是发生在目的片段内部，也就造成了模板的减少，给PCR带来不良影响。

2.另外就是糖原的量。

在我的操作中为了使C==》T的转化比较彻底，我加大了整个反应
体系（也就是用传统的样品量，但是各种试剂均加倍，这样也便于操作，每步丢失的东西也相对较少），这样在最后回收的时候糖原的作用就尤其的重要了。

具体加多少要看大家各自的体系了。

我是0.7ml的体系中加了24微克糖原，在-20度存放了30min后，12，000rpm，10min离心，最后收取的DNA行PCR，效果还可以。

3.乙醇沉淀看不到沉淀的原因主要有以下几种可能：○1DNA的量比较少；○2DNA的量不
是很少，但是很纯，也很难看到（有就是说有蛋白质什么的一些异物的时候倒是比较容易看到沉淀，所以如果一下子就看到沉淀了未必是好事）；○3没有沉淀下来。

4.在做bisulfite sequencing中，在沉淀的时候一定要加糖原，效果很好的。

一般加了糖原
之后是可以看到沉淀的。

糖原要在加了醋酸钠以后，加入乙醇（或异丙醇）之前加入的。

5.其实经bisulfite处理之后的DNA也没有脆弱到那种马上就消失的地步。

只是在处理的
过程中，一定要注意轻柔，不要让你的人马在半路都消耗于非战斗性损伤——单链的DNA（也就是氢氧化钠处理之后的DNA）还是很容易受伤的，剧烈的振荡足以使之殒命。