甲基化实验方法和步骤

实战经验：

甲基化检测方法总结——（亚硫酸氢盐修饰后测序法）

第一部分基因组DNA的提取

这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。DNA 比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。

此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。使用两者的细节：

1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；

2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。两者均于-20度保存。

验证提取DNA的纯度的方法有二：

1：紫外分光光度计计算OD比值；

2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。

我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA 的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。

第一天只需下午半天即可

下午3点开始，先配好试剂再开始做实验

需提前消毒的物品：1.5mlEP管一大盒，双蒸水200ml，15ml

离心管，开水浴锅，

第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA

如不特别指出，所用双蒸水均经高压蒸汽灭菌。

1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用双蒸水稀释至45ul【20ulDNA+25ul双蒸水】；2：加5ul新鲜配制的3M NaOH【0.12g定容到1ml，用1.5mlEP管配制】；

3： 42℃水浴30min；水浴完后把水浴锅调至50℃

水浴期间配制： 4：20mM对苯二酚氢醌【0.022g氢醌定容至10ml，用15ml离心管配】，加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）

5： 3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：用15ml离心管配，1.88 g 亚硫酸氢钠使用3ml 双蒸水稀释，【一次性加350ul 3M NaOH，，然后谨慎每次加入10ul 3M NaOH仔细观察】并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。PH 一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。

6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。

8：用浮漂固定EP管50℃避光水浴16h。

一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am 以后收，时间上很合适。

这一步细节：

1)基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有

丢失，且此方法修饰最多可至4ug。

2)所有试剂均须新鲜配制，所以配液的技术要过关，既要快，又要精确。

3)亚硫酸氢钠溶液呈强酸性，一定用碱将PH调制5.0，否则PH不合适会影响

后续纯化吸收。

4)水浴最好达16小时，虽可以短至8小时，但后者修饰会有不完全。

第二天只需要上午半天即可

上午8点开始配试剂：开水浴锅70℃

4ml 冰无水乙醇放于-20℃【4ml EP管配制】

配制10ml 80%异丙醇【15ml离心管配制】

5ml注射器2个

10M 乙酸铵【用4ml EP管配制，0.778g乙酸铵定容至1ml】

3M NaOH【0.12g定容到1ml，用1.5mlEP管配制】；

上述溶液配制完后将双蒸水放于水浴锅内

第三部分修饰后DNA纯化回收

2：以下使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统（Promega，A7280）

1）70℃水浴预热DDW；配制80%异丙醇；

2）加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin【用之前一定记得摇摇树脂瓶子，混匀树脂】，轻柔颠倒混匀，使DNA充分与树脂结合；

3）由于该试剂盒中仅配备针筒没有针栓，自备5ml注射器。将注射器针筒【切记拔掉针栓后再连接】与试剂盒提供的回收小柱【在回收小柱上做标记】紧密连接后，将上述混合物用移液器移至针筒内，用4ml EP管放置小柱下接收废液。加针栓，轻轻加压，将液体挤出，此时可见小柱内有白色的树脂沉积。

4）将注射器与小柱分离后拔出针栓，再将针筒与小柱连接，向针筒内加入2ml 80％的异丙醇，插入针栓，轻轻加压，将异丙醇挤出。此为洗涤步骤。此步骤操作2次。

5）将注射器与小柱分离，将小柱置于洁净1.5ml洁净EP管上，盖紧盖子，离心12000rpm，2min，以甩去残余异丙醇成分，使树脂干燥。此时，修饰后DNA处于与树脂结合状态。6）将小柱取下置于另一洁净1.5mlEP管上，移液器加45ul【分2次加2次离心，第一次加25ul离心，第二次加20ul离心】预热好的DDW，室温放置5min。

7）离心12000rpm，20s，此为洗脱步骤，此时EP管内液体即为洗脱的修饰后DNA溶液，终体积为45ul。

3：加5ul 新鲜配制的3M NaOH，室温放置15min。

4：加33ul 10M乙酸铵，以中和NaOH，使溶液PH于7.0左右。

5：加2ul 20mg/ml糖原，此作为沉淀指示剂，因为其与乙醇混合后可产生沉淀，便于以后

离心后辨别回收物的位置，以防在吸取残余乙醇时将回收物吸走。

6：加270ul 冰无水乙醇，置于-80度，过夜沉淀。

第二天中午11:30分左右即可完成！

此步细节：

1)在使用注射器时，一定要用力均匀且轻，如使用暴力，会将小柱内的薄膜挤破，失去作

用。

2)乙酸铵、糖原不需新鲜配制，糖原配好后放在-20度保存，乙酸铵室温即可，因为这样

浓度的乙酸铵非常难溶，一旦放在4度，取出用时也会有很多溶质析出。

3)异丙醇、70%乙醇都不需要新鲜配制，但如果用量大，现场配也很方便。

此步关键是在树脂与DNA的结合上，这就再次强调第二部分调亚硫酸钠PH值得重要性。因为树脂与DNA结合需要有一个适当的PH，如前一步没做好，此步树脂不能与DNA很好结合，将会带来灾难性后果，即DNA随着液体被挤出了，洗脱时实际已没有任何DNA了。