低温和冷冻保护剂_DMSO_对卵细胞的影响

低温和冷冻保护剂(DMSO)对卵细胞的影响

孙兴参,岳奎忠,伊亚玲

(东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150030)

中图分类号:S821.3+4 文献标识码:A 文章编号:1004-7034(2002)05-0007-02

关键词:卵母细胞;平衡;二甲基亚枫;非整倍体小鼠

摘　要:实验以小鼠为动物模型,研究延长小鼠卵母细胞在含有冷冻保护剂的液体中的平衡时间、并且降低平衡时的温度是否能影响卵母细胞完成减数分裂时染色体的倍性。结果表明:①在含有DMSO的液体中平衡卵母细胞的非整倍体率同对照组没有明显差异,但是卵母细胞在没有DMSO的液体中平衡,非整倍体率明显增加;②有DMSO时0℃平衡15和60min后卵母细胞非整倍体率没有发生明显变化;③卵母细胞在1.5mol/L的DMSO液体中24℃平衡,卵母细胞的非整倍体率明显增加。这些结果表明:1.5mol/L的DMSO0℃平衡对卵母细胞的染色体倍性有保护作用。

由于卵母细胞冷冻对于濒危物种的保存以及相关技术如胚胎体外生产、细胞核移植和转基因技术实际应用都有重要意义。卵母细胞的冷冻成为动物繁殖技术的研究热点之一[1]。同胚胎冷冻一样,卵母细胞冷冻也有慢速冷冻和玻璃化冷冻两种方法。虽然现在有应用玻璃化法冷冻卵母细胞研究报道,但是慢速冷冻目前仍是最好的方法。据Carrols[2]报道,采用慢速冷冻方法冷冻小鼠卵母细胞,解冻后有80%以上的卵母细胞形态正常。尽管如此,卵母细胞冷冻还有许多不足之处,成功率远低于胚胎冷冻。可能与卵母细胞对温度变化比较敏感有关[3]。而冷冻过程又很复杂。比如慢速冷冻卵母细胞时要应用冷冻保护剂如DMSO等,而且要在含有冷冻保护剂的液体中一定温度下平衡一定时间;另外在实际操作过程中,一般冷冻卵母细胞的数量较多,操作花费时间较长,不可能非常准确的控制平衡时间。研究表明,当卵母细胞冷却到0℃时,如果没有DMSO或其它冷冻保护剂时,卵母细胞的细胞骨架结构会被破坏;另外卵母细胞在含有冷冻保护剂的液体中室温下平衡也能破坏卵母细胞的细胞骨架结构,结果都能引起染色体倍性异常,损害胚胎发育[4]。

所以本实验以小鼠为动物模型,研究延长小鼠卵母细胞在含有冷冻保护剂的液体中的平衡时间、并且降低平衡时的温度是否能影响卵母细胞完成减数分裂时染色体的倍性。

2　材料与方法

2.1　卵母细胞的收集

所用实验动物为昆明白小鼠。均饲养在严格控光的条件下,光照14h(6:00～20:00),黑暗10个h(20:00～6:00)。雌鼠于下午3:00腹腔注射孕马再清促性腺激素(PMSG,天津实验动物中心生产)10IU/只,间隔48h后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(HCG,宁波市激素制品厂生产)10IU/只,进行超数排卵。于HCG后17h从输卵管收集成熟卵母细胞。

2.2　冷冻保护剂作用时间

卵母细胞在含有1.5mol/L的DMSO中于0℃和24℃平衡不同的时间。0℃平衡处理时,向1.5mL离心管中移入150μLM12+FCS或150μL M2+FCS+1.5mol/L的DMSO,这些离心管事先放置在冰浴上,然后再移入卵母细胞。在这种条件下,卵母细胞于0℃平衡15min或60min。然后将离心

收稿日期:2001-02-08

基金项目:东北农业大学青年科学基金资助

作者简介:孙兴参(1970-),男,吉林梅河口人,讲师,主要从事动物组织胚胎学研究兼教学工作.管移到室温(22℃)中停留5min,后缓慢加入1mL M2液,回收卵母细胞,用M2清洗三遍,备用。卵母细胞在不含DMSO 的M2液中平衡时也做类似的处理。24℃平衡处理时,卵母细胞在含DMSO的M2液中平衡15或60min。对照组为不经任何平衡处理直接进行激活。

2.3　卵母细胞的激活

采用两种方法激活卵母细胞。一是电激活,将卵母细胞于电激液中(0.3M甘露醇,50um Ca,100um Mg)经0.8kv/cm、60us、2次脉冲激活,然后于M16液中培养6h。二是化学激活,用+10mMSr2+—Ca2+M16中作用2h,然后在M16培养4 h。6h后在相差显微镜下观察激活情况。只有出现原核的,才判定为激活。原核类型主要有:1原核2极体、1原核、2原核。

2.4　染色体倍性分析

选择形成l原核2极体的激活卵母细胞在含有1μg/mL 秋水仙胺的MI6液体中培养16h。然后用低渗肿胀法制做染色体,进行倍性分析。

2.5　数据分析

每组实验至少重复3次,所有的百分比数据都经正强转换,然后采用SPSS软件实施单因素方差分析,进行多重比较, P<0.05被认为是差异显著。

3　结果

3.1　不同激活方法对卵母细胞原核组成的影响

我们首先比较了不同激活方法对卵母细胞激活率和活化卵母细胞原核类型进行了比较,结果表明,用Sr2+激活卵母细胞的激活率明显高于用电激活的方法,而且激活卵母细胞的类型比较稳定,形成1原核2极体的比率为98.5%。

表1　不同激活方法对卵母细胞核组成的影响

激活方法

激活率

/(%)

激活卵母细胞原核类型/激活卵数

1原核2极体1原核2原核

化学激活98.5a98.50.001.5

电激活79.7b45.135.319.6

3.2　DMSO对0℃平衡15min后卵母细胞的染色体倍性的影响

在含有DMSO的液体中0℃平衡l5min后卵母细胞的非整倍体率同对照组没有明显差异,但是卵母细胞在没有DMSO 的液体中平衡,非整倍体率明显增加。

3.3　1.5mol/L的DMSO液体中0℃平衡15和60min,激活并进行染色体分析

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低温和冷冻保护剂(DMSO)对卵细胞的影响-孙兴参

Heilongjiang Journal of Animal

Science and Veterinary Medicine