同工酶

一、实验课题: 蝗虫酯酶同工酶

二、文献综述：

对锥头蝗科、斑腿蝗科、剑角蝗科和斑翅蝗科９种蝗虫进行了酯酶同工酶分析．通过生化特征，探讨较高级分类阶元之间的差异，研究结果表明，９种蝗虫共显现２６条酶带，种间没有出现共同酶带，不同科样品之间酶谱差异很大，显而易见，同属不同种间的相似性大于同科不同属种间的相似程度，后者又明显大于不同科种间的相似性。【1】以酶酯同工酶法进行同工酶的电泳实验可以得到同工酶酶谱，进而可以得到各种昆虫之间的亲属关系，为蝗虫的分类提供了快速有效的方法。【2】

【1】《9种蝗虫酯酶同工酶研究》（韩雅莉; 谭竹钧; 郑哲民内蒙古大学学报(自然科学版)）

【2】《酯酶同工酶多态性及其在昆虫分类学中的应用价值》（郭晓霞; 郑哲民; 于广志;昆虫知识2000年06期）

三、实验目的和要求：

1.了解酯酶同工酶的实验方法，掌握PAGE的基本原理。

2.了解蝗虫属种之间的相关性大小。

3.学会看并记录酶谱的相关现象和数据。

四、实验条件：

实验材料：

锥头蝗科：长额负蝗（大别山），短额负蝗（黄州）

斑翅蝗科：花胫绿纹蝗，疣蝗

剑角蝗科：中华蚱蜢

斑腿蝗科：

稻蝗亚科：中华稻蝗（黄州），山稻蝗（大别山）

蔗蝗亚科：斑角蔗蝗

黑蝗亚科：绿腿腹露蝗

秃蝗亚科：霍山蹦蝗

刺胸蝗亚科：棉蝗

仪器与试剂：

0.2mol/L Na2HPO4500ml：Na2HPO4∙2H2O 17.81g（或Na2HPO4∙12H2O 35.82g），

加水至500ml； 0.2mol/L NaH

2PO

4

500ml：NaH

2

PO

4

∙H

2

O 13.80g（或NaH

2

PO

4

∙2H

2

O 15.60g），加水至500ml；

分离胶贮备液100 ml：1mol/L HCL 48ml，Tris 36.3g，加水至100ml，PH 8.9；

浓缩胶贮备液100 ml：1mol/L HCL 48ml，Tris 5.98g，加水至100ml，PH 6.7；

Acr+Bis混合液：Acr 30g，Bis 0.8g，加水至100ml；

电极缓冲液2000 ml：Tris 12g，甘氨酸 57.6g，加水至2000ml，PH8.3；

10% AP 10ml；

40%蔗糖 200ml ；

7%乙酸 500ml；

TEMED

溴酚兰指示剂。

细沙（1小杯），EP管（5ml，1.5ml各60个），研钵6-8个，枪头（白色1盒，黄色1盒，蓝色2盒）。

琼脂粉，正丁醇，蒸馏水，甘油，PH试纸，滤纸，手套。

垂直板电泳槽，电泳仪，电极线，磁盘3-4个，小刀1把，记号笔，移液枪（1000ul，100ul，20ul），移液管，吸管，玻璃棒，大、小烧杯，量筒，

1ml注射器4个。

五、实验原理和方法：

同工酶(isozyme)：催化同一生化反应的、在电场中的运动性质有所不同的一组酶，具有组织、发育及物种的特异性。

酯酶同工酶(Esterase)：催化酯类化合物水解的酶类，其作用是催化酯键的水解和合成，反应式为：

一般来说酯酶在生物体内以单体或二聚体的形式起作用，是最复杂最具有多态性的酶系。到目前为止，已发现的酯酶有20多种，这20种酯酶在生

物化学上广义地称为酯酶，但其中只有一部分能用组织化学方法证明。这

些能被证明的酯酶分为两大类：一类是没有底物特异性的非特异性酯酶

(nonspecific esterase)，另一类是有底物特异性的特异性酯酶。通常狭

义的酯酶仅指前者，根据它对抑制剂的反应，可区分为芳香基酯酶、羧酸

酯酶、乙酰酯酶等，这些酯酶对底物的特异性不强，酶分子多态现象较普

遍。特异性酯酶，根据它的底物特异性可分为：分解高级脂肪酸酸的酯酶、

分解乙酰胆碱酯的乙酰胆碱酯酶、分解胆碱酯的胆碱酯酶等。

染色原理：

PAGE基本原理：

聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶(PAG)作为支持物的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(Acr)单体和双体双丙烯酰胺(Bis)在催化剂作

用下聚合成具有三维网状结构和一定孔径的大分子物质，分离物能否通过凝胶及通过的速度取决于凝胶孔径的大小，而凝胶孔径大小由单体和双体在凝胶中的总浓度(T)，以及双体占总浓度的百分含量(C)即交联度决定，其计算公式为：

式中a代表单体的重量(g)；b代表双体的重量(g)；m代表溶液的体积(ml)。由上可知，凝胶浓度不同，其交联度不同。交联度随总浓度度(T)的增加而降低。因此，当总浓度一定、交联度增加时，筛孔直径降低。根据这个道理，Richard 等在1965年提出了适合于确定凝胶浓度为5%-20%范围内交联度的经验公式: C= 6.5-0.3T。

1、当分析一个未知样品时，常选用7.5%的标准凝胶或用4%-10%的梯度凝胶试验，以便达到理想浓度的凝胶。

2、本实验采用电泳基质的高PH不连续体系(即凝胶层的不连续性，缓冲液离子成分的不连续性、PH的不连续性及电位梯度的不连续性)，凝胶选用AP一TEMED 催化系统。上层凝胶为浓缩胶(大孔胶)，T=2.5%，PH6.7，孔径大，样品在此层胶中按分子大小和静电荷多少初步分层浓缩；下层凝胶为分离胶(小孔胶)，T=7.5%，PH8.9，孔径小，被初步浓缩的样品进人分离胶后，由于分子筛效应和电荷效应使样品进一步浓缩并分离成细带。

六、实验步骤：

(l) 样品制备

a、取蝗虫后足股节，蒸馏水冲洗，置冰浴预冷的研钵中，加适量提取液

0.1M磷酸缓冲液及少量石英砂，冰浴中迅速磨成匀浆后倒人5ml尖底离

心管。

b、置入4℃冰箱4h以上，但不宜超过一天，以免酶活性降低。

c、8000-12000转/分钟离心15-20分钟，贮于-4℃下待用。

d、点样时吸取其上清液。

若需较长时间保存样品酶液，则用注射器移上清液至1.5ml带盖离心管，并覆盖等体积40%蔗糖，置于-20℃低温保存，两月内酶活性仍有效。(2) 电泳贮藏液及凝胶配制(见表2)