镍离子金属亲和层析柱在蛋白质纯化中的应用2
镍离子金属亲和层析柱在蛋白质纯化中的应用
摘要：蛋白质纯化是进行基因工程中最重要的环节，选取纯化蛋白的工具对纯化结果影响巨大。镍离子亲和层析柱具有特异性高、纯度高、成本低、产量大等优点，镍离子亲和层析柱的国产化将极大促进蛋白质纯化产业的发展并会产生巨大的市场效益。
关键词：镍离子亲和层析柱、蛋白质纯化、国产化
亲和层析（Affinity chromatography，AC）是利用生物大分子和固定相表面的亲和配基之间可逆的特异性相互作用，进行选择性分离的一种液相层析分离方法。常用的亲和层析方式为金属螯合亲和层析,又称固定化金属离子亲和层析( Immobilized metal lchelated affinity chromatography, IMAC)，利用金属离子(Ni2+，Cu2+等)与氨基酸表面的残基(如组氨酸的咪唑基)的配位鳌合作用，来纯化与金属离子有亲和作用的蛋白质。由于IMAC 具有螯合介质制备简单方便，吸附容量大，选择性及通用性较好，易于再生，成本低等优点, 逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一。镍离子亲和层析柱成为金属螯合亲和层析的代表产品。目前，国外有3-4家镍离子亲和层析柱产品在国内销售，但价格昂贵，国内已有数家公司开展了镍离子亲和层析柱产品的销售，其中，广州精达公司采用最新的镍离子亲和层析柱的制备技术，顺利完成了该种产品的国产化。
I、镍离子亲和层析柱的制备工艺
1、Ni2+吸附融合蛋白原理
Ni柱中的氯化镍或者硫酸镍可以与有His（组蛋白）标签的碱性蛋白结合，组蛋白标签一般是6个组氨酸（碱性氨基酸）。同时Ni柱中的氯化镍或者硫酸镍也可以与咪唑结合，利用咪唑梯度洗脱，从而获得纯度较高的融合蛋白。而利用基因工程技术制备的融合蛋白常携带6个组氨酸的标签，因6个组氨酸标签因肽片段小，故对目标蛋白质的生物活性影响较小，因此被广泛用于重组蛋白的制备及纯化。
2、固相载体的选择
常见的固相载体包括为普通琼脂糖颗粒及GE公司生产的Sepharose琼脂糖系列产品。普通的琼脂糖颗粒具有造价低，但结合蛋白不稳定，易造成镍离子脱落的重大缺点。而GE公司生产的Sepharose琼脂糖系列产品采用交联琼脂糖，具有高吸附力、高化学物理稳定性、快流速、强抗压力等特点，因此十分适合作为亲和层析柱中的固相载
体。该系列包含有几类产品包括：Sepharose 4B、Sepharose 6B、Sepharose 4FF、Sepharose 6FF等。实验发现Sepharose 4B的空间位阻效应较小，可结合较大量的蛋白质，而且还克服了Sepharose 6B流速慢的缺点，在蛋白质纯化中能够得到相同的结果，因此，采用Sepharose 4B成为当前较好的选择。
3、配基的选择
常见的配基包括次氮基三乙酸（Nitrilotriacetic acid，NTA）及亚氨基二乙酸（Iminodiacetic Acid，IDA）。NTA中的一个氮原子、三个氧原子与金属离子结合后，金属离子空余两个空轨道与蛋白质结合。而IDA则是一个氮原子、两个氧原子与金属离子结合，金属离子空余三个空轨道与蛋白质结合。因此，IDA具有更高的蛋白质结合能力，利用IDA具备的镍离子金属亲和层析柱具有更高吸附蛋白质的能力，因而被广泛运用。
II、广州精达公司镍离子亲和层析柱
镍离子亲和层析柱在纯化蛋白中用量大，运用范围广，相较于价格较高的国外产品，生产价格便宜且性能更为良好的国内产品成为当前迫切需要解决的问题。
广州精达医学科技有限公司是由美国免疫学博士胡勇创立的生物医药公司。公司制备镍离子亲和层析柱选购国外原材料，同时采用全套的美国生产工艺（图1），同时采用先进的偶联技术，降低生产成本，具备大规模产业化资质。
图1
采用先进的化学偶联技术，将镍离子与琼脂糖Sepharose 4B进行结合，同时连接IDA配基结合镍离子，制备成镍离子亲和层析柱（Ni2+-IDA）。用户在使用层析柱时，粗蛋白样品中目的融合蛋白与镍离子特异性结合，其他杂蛋白因为不能与镍离子结合而穿过层析柱。结合在柱子上的融合蛋白可以用梯度咪唑进行洗脱使之解离，用收集管编号收集以达到纯化蛋白质的目的。一般管中收集的融合蛋白用蛋白胶（SDS-PAGE）进行检测，并判断蛋白的纯度及浓度。
图2显示的为广州精达公司镍离子亲和层析柱纯化融合蛋白的效果图（SDS-PAGE 电泳胶）。根据图中显示，经精达公司层析柱洗脱后，纯化的融合蛋白纯度高、杂蛋白含量低，纯化效果良好。
广州精达公司镍离子亲和层析凝胶及亲和层析柱产品可参见图3。
融合蛋白的纯化对基因工程后续实验具有十分重要的意义，包括获得单一活性蛋白质用于产品生产，或用于制备抗原，纯度越高的抗原所获得的抗体纯度越高，高质量的抗体又可用于其他实验及产品中，产值巨大。
蛋白纯化离子交换层析
蛋白纯化离子交换层析 离子交换层析技术是以离子交换剂为固定相，常见的离子交换剂是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质，通过共价键结合某种电荷基团，形成带电基质，带异性电荷的平衡离子能够通过静电力作用结合在电荷基质上，而平衡离子能够与样品流动相中的离子基团发生可逆交换而吸附在交换剂上，不同带电荷蛋白间结合吸附固定相的能力不同。离子交换技术就是根据蛋白质样品间带电性质的差别而进行分离的一种层析方法。 常见的离子交换剂有离子交换纤维素、离子交换树脂和离子交换葡聚糖凝胶。根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的性质不同，可以将离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂，在阳离子交换剂中，带正电荷的平衡离子能够和流动相中带正电荷的离子基团进行交换。例如DEAE纤维素阳离子交换剂，当纤维素交换剂分子上结合阳离子基团二乙氨乙基（DEAE）时，形成阳离子纤维素—O—C6 H14N+H，可与带负电荷的蛋白质进行结合，交换阴离子。 根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的解离度不同，又可以分为强酸型、中等酸型、弱酸型三类阳离子交换剂，强酸型离子交换剂在较大的pH范围内电荷基团完全解离，而弱酸型只能在较小的pH范围内完全解离，如结合羧甲基的离子交换剂在pH小于6时就失去了交换能力。 强酸型阳离子交换剂一般结合的基团有：磺酸甲基、磺酸乙基；中等酸型阳离子交换剂有：磷酸基团和亚磷酸基团；弱酸型离子交换剂有：酚羟基和羧基类； 在阴离子交换剂中，带负电荷的平衡离子能与流动相中带负电的离子基团进行交换，例如阴离子交换剂CM纤维素，当纤维素交换剂分子上结合羧甲基（CM）时，形成带有负电荷的阴离子（纤维素－O－CH2－COO一），可与带正电荷蛋白质结合，交换阳离子。 根据与高分子聚合物基质共价结合的电荷基团的解离度不同，可分为强碱型、中等碱型、弱碱型阴离子交换剂。一般结合季胺基团基质的交换剂为强碱型离子交换剂，结合叔胺、仲胺、伯胺等为中等或者弱碱型离子交换剂。 蛋白质是两性电解质，当溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，蛋白质的静电荷为0，当溶液pH值大于蛋白质等电点时，羧基电离，蛋白质带负电荷，蛋白质能够被阴离子交换剂所吸附，相反，当溶液的pH值小于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷，被阳离子交换剂所吸附，溶液的pH值距蛋白质等电点越远，蛋白质带电荷越多，与交换剂的结合程度也越强，反之则越弱。 当溶液的pH值发生改变时，蛋白质与交换剂的吸附作用也发生变化，因此可以通过改变洗脱液的pH值来改变蛋白对交换剂的吸附能力，从而把不同的蛋白质逐个分离，当pH值增高时，抑制蛋白质阳离子化，随之对阳离子交换剂的吸附力减弱，当pH值降低时，抑制蛋白质阴离子化，随之降低蛋白质对阴离子交换剂的吸附。 另外，无机盐离子（如NaCl）对交换剂也具有交换吸附的能力，当洗脱液中的离子强度增加时，无机盐离子和蛋白质竞争吸附交换剂。当Cl-的浓度大时，蛋白质不容易被吸附，吸附后也易于被洗脱，当Cl-浓度小时，蛋白质易被吸附，吸附后也不容易被洗脱。 因此，洗脱阴离子交换剂结合的蛋白时，则降低pH值，增加盐离子浓度；洗脱阳离子交换剂结合蛋白时，则升高溶液pH值，增加盐离子浓度，能够洗脱交换剂上的结合蛋白。
蛋白纯化层析柱
蛋白纯化层析 从个人学术性实验室到大型的医药制造企业，小型或者大规模的蛋白纯化通常都需要几种类型的液相色谱仪。这些相关的大部分技术已应用了多年，但是新型柱料的发展为这些利用蛋白物理和化学特性进行分离的，经过时间考验的方法注入了新的力量。其中最值得提到的就是凝胶过滤层析技术（gel filtration，GF），离子交换层析技术（ion exchange，IEX），羟基磷灰石层析（hydroxyapatite，HAP）和疏水作用层析（hydrophobic interaction，HI)，以及亲和层析和高效液相色谱方法（high-performance liquid chromatography，HPLC）。 对于一个初接触蛋白纯化的新手而言，从哪儿下手也许是令人头疼的一件事，但是幸运的是目前这些流程都已经逐步系统化了。GE Healthcare（原Amersham Biosciences）的技术顾问Andrew Mitchell 解释道，通常利用液相色谱技术进行蛋白纯化有三步： 捕获——从细胞其它成份，比如DNA和RNA中分离需要的蛋白； 区分——从与目的蛋白具有相近的大小，或者相似的物理/化学特征的污染物中分离蛋白； 修饰——使分离得到的样品处于可使用状态。 这每一个纯化的步骤都有特定的色谱层析技术和最佳的beads大小。第一步捕获步骤，也就是从细胞裂解物粗成份中分离蛋白，这需要一个具有高容量和高流量（flow rate）的填料。bead大小比较大，范围比较宽（比较于bead大小平均值）的“fast flow”填料比较理想，
这种填料也有利于防止目标蛋白被水解——因为速度比较快。 第二步则对分辨率要求更高，需要更好的从混合物中分离需要的成份。通常bead的大小与分辨率成反比，因此在这一部中比较小的bead 比较合适。吸附性的技术，比如离子交换IEX和疏水作用HI通常被用在纯化的这前两个步骤，而凝胶过滤则会留到了最后的修饰那一步，用于小体积，高浓度的样品。另外要注意，进行凝胶过滤层析时，样品的体积应该保持在柱床体积的1%到4%。 选择柱料的时候有两个因素要考虑到，针对目的蛋白的选择性和有效性——这些可以由洗脱峰的宽度来说明。其中选择性主要是指填料与目的蛋白相互作用以及结合的能力，IEX和HI层析方法就是指目标分子与筛分介质之间的相互作用，而GF的选择性依赖于填料的分馏范围（fractionation range）。 柱料的有效性则是指层析介质洗脱样品得到显著层析峰的能力，Mitchell表示，“如果你的峰值不集中，比较宽，那么即使是选择性很好，分辨率仍然会被消弱”。bead越大，洗脱峰就越不集中，柱子的有效性就越低。纯化洗脱相近的蛋白需要高效性，高选择性和高效性的结合就会得到高分辨率。 凝胶过滤层析(gel filtration chromatography) 凝胶过滤法（gel filtration）也称为排阻层析（exclusion chromatography）、凝胶层析（gel chromatography）或分子筛层析（molecular sieve chromatofraphy），它是在1960年后发展出来的技术。
A蛋白亲和层析法纯化单克隆抗体
摘要：世界首个单克隆抗体（monoclonal antibody，简称单抗）于1986 年，获得美国食品与药品监督管理局的上市批准，拉开了单抗药物发展的序幕，成为生物医药领域中最耀眼的明珠。单克隆抗体纯化过程中a蛋白（protein a）层析介质的选择尤为重要，可以影响抗体的纯度。本文主要阐述单抗纯化过程中a蛋白亲和层析的相关内容。 关键词：a蛋白；耐碱性；动态载量 全球医药行业走向趋势是精准医疗时代，单抗是其中较为成熟的领域，引领了生物制药产业发展最为重要的驱动力。单抗药物主要是由中国仓鼠卵巢细胞（chinese hamster ovary cell，简称 cho 细胞）表达产生，由 cho 细胞分泌的外源蛋白分子，通过纯化过程实现由细胞培养液中回收。随着单抗生产上游改造、培养参数的优化，其产量已达5-10g/l，同时也增加了下游蛋白回收中去除各种宿主杂质的负担。宿主蛋白残留的组成随着培养条件的改变显现出显著的变化，单抗药物杂质主要包括与产品相关的污染物和工艺相关的污染物。 根据终产品纯度、杂质含量的严格要求，单抗目前采用三步纯化策略：粗纯（样品捕获）、中度纯化和精细纯化，该策略工艺复杂、对操作要求严格，导致纯化成本一般占总生产成本的 50%-80%。用a蛋白亲和层析凝胶捕获抗体是大规模单抗纯化的首要步骤，一步纯化可使蛋白纯度达 95%以上。但a蛋白树脂价格昂贵，在大规模生产中，a蛋白纯化步骤的成本占整个抗体纯化成本的 35%以上。因此，蛋白 a 纯化效率的提高是进一步提高产品质量、降低生产成本的关键[1]。 1 a蛋白的性质金黄色葡萄球菌 a蛋白（staphylococal protein a，spa）是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质。能特异性地与人或哺乳动物抗体（主要是igg）的fc区域结合。天然的a蛋白是十种氨基酸组成。由于不含有胱氨酸及半胱氨酸，所以无二硫键。紫外光谱和吸收系数为 a275nm %=1.65，等电点为ph5.1。spa十分稳定，用4mol/l尿素、硫氰盐酸、6mol/l的盐酸胍和ph2.5的酸性条件，以及加热煮沸均不影响其活性。分子量：全长的spa 54kd，去掉与细胞壁结合部分的spa 42kd。spa与igg结合的亚类主要是igg1、igg2和igg4。近几年来基因工程的spa出现，解决了天然a蛋白的耐碱性问题，mabselect sure是基因工程的spa，去掉了天然spa的dace 区域，对于b区域进行了修饰，将不耐受naoh的氨基酸去掉。使修饰后的spa可以耐受0.1-0.5m的naoh；这就很好的解决了层析介质cip的问题，同时修饰后的spa也耐受蛋白酶。减少在纯化过程中蛋白酶对spa的作用，使洗脱收集液中spa的脱落更低。 2 结合单抗的a蛋白层析介质的选择 在a蛋白捕获步骤中主要去除的杂质大部分是hcp和基因组dna；由于a蛋白层析介质对聚体没有去除作用，所以在此捕获步骤中应采取尽量减少聚体的形成策略，例如：提高洗脱ph，加入添加剂等；在此捕获步骤中会有a蛋白（配基）的脱落。在a蛋白捕获过程中，培养上清中的蛋白酶会降解层析介质的配基a蛋白，以及a蛋白与介质骨架的偶联方式，这些都是protein a的脱落原因，所以选择a蛋白脱落较低的层析介质是非常必要的[2]。 2.1 a蛋白层析介质相关指标 耐碱性：药物gmp生产最基本的要求是无菌、无热源。naoh 是最好的除菌、出热源的试剂。同时naoh也是公认的cip试剂，使用naoh 可以很好的除去残留在层析介质上的杂质，以确保工艺的稳定性以及层析介质的寿命；?郧?naoh的成本低。naoh是公认的cip试剂，实验表明，naoh的清洗效果高于其他试剂，适合琼脂糖基架的填料。而对照的可控玻璃基架（cpg）填料的清洗结果表明，盐酸胍比磷酸更为有效。cpg填料在高ph下不稳定，不适合用naoh 清洗。传统的a蛋白的清洗试剂，如：尿素，盐酸胍等的清洗试剂效果不理想，?郧以谂渲檬
重组蛋白和多肽的分离纯化
重组蛋白和多肽的分离纯化 1.概述 分离纯化组成了基因工程的下游处理（downstream processing）阶段，这一过程又和上游过程紧密相联系，上游过程的诸方面影响到下游的分离纯化，所以在进行目标蛋白质表达纯化时要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游因素对下游的影响，如是否带有亲和标签，是否进行分泌表达。目前应用最广泛的表达系统有三大类，分别是大肠杆菌表达系统、酵母表达系统和CHO细胞表达系统，不同的表达系统和培养方法显著影响下游的处理过程，目标蛋白表达是否形成包涵体，目标蛋白表达的定位（胞内、细胞内膜、周质空间和胞外），蛋白表达的量都依赖于所选择的表达系统。选择将所表达的蛋白分泌到细胞外或周质空间可以避免破碎细胞的步骤，并且由于蛋白质种类少，目标蛋白容易纯化；而在细胞质内表达蛋白，可能是可溶性表达，可能形成包涵体，可溶性的蛋白往往需要复杂的纯化步骤，而包涵体易于分离，纯度较高，但回收具有生物活性的蛋白却变的相当困难，需要对聚集的蛋白进行变复性，通常活性蛋白的得率比较低，表1列出了不同策略对表达、纯化的影响，对于其中的有些缺点可以通过一定的方法进行克服和避免，如利用DNA重组技术给外源蛋白加上一个亲和纯化的标签，有助于可溶性外源蛋白的选择性纯化，并能保护目标蛋白不被降解（96）。 表 1 重组蛋白不同表达策略的优点和缺点 表达策略优点缺点 分泌表达至细胞外增强正确二硫键的形成 降低蛋白酶对表达蛋白的降解 可获得确定的N末端 显著减少杂蛋白水平，简化纯化 不需要细胞破碎表达水平低 多数蛋白不能进行分泌表达表达蛋白需要进行浓缩 细胞周质空间表达增强正确二硫键的形成 可获得确定的N末端 显著减少杂蛋白水平，简化纯化好些蛋白不能分泌进入周质空间 没有大规模选择性的释放周质空间蛋白的技术 周质蛋白酶可引起重组蛋白酶解 胞内包涵体表达包涵体易于分离 保护蛋白质不被降解 蛋白质不具有活性对宿主细胞生长 没有大的影响，通常可获得高的表 达水平需要体外的折叠和溶解，得率较低具有不确定N末端 胞内可溶性蛋白表达不需要体外溶解和折叠 一般具有正确的结构和功能高水平的表达常难以得到需要复杂的纯化 可发生蛋白质的酶解 具有不确定的N末端 在细胞的提取物中，除了目标蛋白外，还含有其它各种性质的蛋白、核酸、多糖等。在这样一个混合体系中，蛋白质纯化要求将目标蛋白与其它的成分分离，得到一定的量，达到一定的纯度，同时要尽可能保留蛋白的生物活性，并使蛋白保持完整。所以蛋白质的分离纯化可以看作是一系列的分部收集过程，总是希望目标蛋白富集于其中的一个收集部位，而大量的杂蛋白存在于其它的收集部位。当然对目标蛋白纯度的要求要根据纯化蛋白的用途而定，对于治疗性的蛋白要求有大于99%的纯度，并对处方有活性和稳定性的要求，对于某些酶的纯度则要求较低，需要在纯度和得率之间进行一个平衡，所以下游的工艺流程取决于最终对目标蛋白的要求。 蛋白质的功能依赖于蛋白质的结构，对于有生物活性的蛋白质，在分离纯化过程中必须根据目标蛋白的特点，采用合适的操作条件和方法，保证目标蛋白的活性尽量不损失。除了在分离纯化的初期，要采用快速的方法除去影响目标蛋白稳定性的杂质，还要严格控制涉及蛋白质变性的各种因素，来避免蛋白质失去活性。蛋白质的构象稳定性可以通过测定蛋白质变性反应时折叠（f）和去折叠（u）间自由能的变化（ΔG f→u）来衡量，ΔG f→u越大蛋白质就越稳定。根据报导蛋白质的ΔG f→u在5—20kcal/molX围之间，单个氢键可造成0.5—2kcal/mol自由能的变化，一个离子对可造成0.4—1.0kcal/mol自由能的变化，因此ΔG f→u相对比较小，这样天然状态仅仅比去折叠状态稳定一点，所以必须克服蛋
Protocol蛋白质纯化步骤
Protocol 蛋白质纯化方法（镍柱） 柱前操作 1.IPTG诱导后，收菌，8000rpm/min(r/m)离心10min; 2.用Binding Buffer（BB）溶解（每100ml原菌液加BB 20ml),超声裂解30min（工作：5s,停止：5s)，1500r/m离心10min,去除杂质； 3.取上清，12000r/m离心20min, 得包涵体； 4.用含2M尿素的BB洗包涵体，12000r/m离心20min,(上清做电泳）；？？？ 5.用含6M尿素的BB溶解包涵体，12000r/m离心20min,(上清做电泳）； 6.对照电泳结果，将上清或包涵体溶解液上柱； 平衡柱子（柱体积：V） 7. 3V（3倍柱体积）ddH2O(洗乙醇）； 8. 5V Charge Buffer（CB); ？？？ 9. 3V BB; 柱层析 10.上样； 11. 10V Washing Buffer（WB）； 12. 6V Elute Buffer（EB); 13.分管收集，每管1~2ml. 各种缓冲液配方 1. 8×BB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 40mM imidazole(咪唑），pH=7.9 1000ml NaCl: 58.44×4=233.76g Tris-HCl: 121.14×160×10-3=19.3824g Imidazole: 68.08×40×10-3=2.7232g 2. 8×CB: 400mM NiSO4 1000ml NiSO4: 262.8×400×10-3=105.12g 3. 8×WB: 4M NaCl, 160mM Tris-HCl, 480mM imidazole, pH=7.9 1000ml NaCl: 233.76g, Tris-HCl:19.3824g, Imidazole: 32.6784g 4. 4×EB: 2M NaCl, 80mM Tris-HCl, 4M imidazole, pH=7.9 1000ml NaCl: 118.688g, Tris-HCl:9.6912g, Imidazole: 272.32g 5. 6M 尿素 1000ml 尿素：60.06×6=360.36g
蛋白质纯化的一般原则及方法选择
随着分子生物学的发展，越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术，并研制成套试剂盒，使基因克隆表达变得越来越容易lIl。但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的，分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物，以研究其生物学作用，或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游工作来说，分子克隆的下游工作显得更难，蛋白纯化工作非常复杂，除了要保证纯度外，蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白，重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败，因为后者要求规模化，且在每日的应用中要有很好的重复性。本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性，以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。 1 蛋白纯化的一般原则 蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速，颗粒大、粒径分布宽．并可以迅速将蛋白与污染物分开，防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨常用的离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性指树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指蛋白的各成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。 2.各种蛋白纯化方法及优缺点 2.1蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸。在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或特别低，蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白质最常用的盐，因为它在冷的缓冲液中溶解性好，冷的缓冲液有利于保护蛋白的活性。硫酸
蛋白纯化层析柱
蛋白纯化层析柱 2011-06-15 15:19:14 易生物仪器浏览次数:1164 网友评论 0 条 从个人学术性实验室到大型的医药制造企业，小型或者大规模的蛋白纯化通常都需要几种类型的液相色谱仪。这些相关的大部分技术已应用了多年，但是新型柱料的发展为这些利用蛋白物理和化学特性进行分离的，经过时间考验的方法注入了新的力量。其中最值得提到的就是... 关键词:蛋白离子交换分离分子物质树脂从个人学术性实验室到大型的医药制造企业，小型或者大规模的蛋白纯化通常都需要几种类型的液相色谱仪。这些相关的大部分技术已应用了多年，但是新型柱料的发展为这些利用蛋白物理和化学特性进行分离的，经过时间考验的方法注入了新的力量。其中最值得提到的就是凝胶过滤层析技术(gel filtration，GF)，离子交换层析技术(ion exchange，IEX)，羟基磷灰石层析(hydroxyapatite，HAP)和疏水作用层析(hydrophobic interaction，HI)，以及亲和层析和高效液相色谱方法(high-performance liquid chromatography，HPLC)。 对于一个初接触蛋白纯化的新手而言，从哪儿下手也许是令人头疼的一件事，但是幸运的是目前这些流程都已经逐步系统化了。GE Healthcare(原Amersham Biosciences)的技术顾问Andrew Mitchell解释道，通常利用液相色谱技术进行蛋白纯化有三步: 捕获——从细胞其它成份，比如DNA和RNA中分离需要的蛋白; 区分——从与目的蛋白具有相近的大小，或者相似的物理/化学特征的污染物中分离蛋白; 修饰——使分离得到的样品处于可使用状态。 这每一个纯化的步骤都有特定的色谱层析技术和最佳的beads大小。
蛋白质纯化的方法选择
蛋白质纯化的方法选择 随着分子生物学的发展，越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种试验技术，并研制成套试剂盒，使基因克隆表达变得越来越容易。但分子生物学的上游工作往往并非是最终目的，分子克隆与表达的关键是要拿到纯的表达产物，以研究其生物学作用，或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。相对与上游工作来说，分子克隆的下游工作显得更难，蛋白纯化工作非常复杂，除了要保证纯度外，蛋白产品还必须保持其生物学活性。纯化工艺必须能够每次都能产生相同数量和质量的蛋白，重复性良好。这就要求应用适应性非常强的方法而不是用能得到纯蛋白的最好方法去纯化蛋白。在实验室条件下的好方法却可能在大规模生产应用中失败，因为后者要求规模化，且在每日的应用中要有很好的重复性。本文综述了蛋白质纯化的基本原则和各种蛋白纯化技术的原理、优点及局限性，以期对蛋白纯化的方法选择及整体方案的制定提供一定的指导。 1、蛋白纯化的一般原则 蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速，颗粒大、粒径分布宽．并可以迅速将蛋白与污染物分开，防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨率，常用离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指各蛋白成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。 2、各种蛋白纯化方法及其优、缺点 2．1 蛋白沉淀蛋白能溶于水是因为其表面有亲水性氨基酸，在蛋白质的等电点处若溶液的离子强度特别高或者特别低，蛋白则倾向于从溶液中析出。硫酸铵是沉淀蛋白最常用的盐，因为它在冷的缓冲液中溶解性好，冷的缓冲液有利于保持目的蛋白的活性。硫酸铵分馏常用作试验室蛋白纯化的第一步，它可以初步粗提蛋白质，去除非蛋白成分。蛋白质在硫酸铵沉淀中较稳定，可以短期在这种状态下保存中间产物，当前蛋白质纯化多采用这种办法进行粗分离翻。在规模化生产上硫酸铵沉淀方法仍存在一些问题，硫酸铵对不锈钢器具的腐蚀性很强。其他的盐如硫酸钠不存在这种问题，但其纯化效果不如硫酸铵。除了盐析外蛋白还可以用多聚物如PEG和防冻剂沉淀出来，PEG是一种惰性物质，同硫酸铵一样对蛋白有稳定效果，在缓慢搅拌下逐渐提高冷的蛋白溶液中的PEG浓度，蛋白沉淀可通过离心或过滤获得，蛋白可在这种状态下长期保存而不损坏。蛋白沉淀对蛋白纯化来说并不是多么好的方法，因为它只能达到几倍的纯化效果，而我们在达到目的前需要上千倍的纯化。其好处是可以把蛋白从混杂有蛋白酶和其他有害杂质的培养基及细胞裂解物中解脱出来。 2．2 缓冲液的更换虽然更换缓冲液不能提高蛋白纯度，但它却在蛋白纯化方案中起着极其重要的作用。不同的蛋白纯化方法需要不同pH及不同离子强度的缓冲液。假如你用硫酸铵将蛋白沉淀出来，毫无疑问蛋白是处在高盐环境中，需要想办法脱盐，可用的方法有利用半透膜透析，通过勤换透析液体去除盐分，此法尚可，但需几个小时，通常要过夜，也难以用于大规模纯化中。新型的设备将透析膜夹在两个板中间，板的一侧加缓冲液，另一侧加需脱盐的蛋白溶液，并在蛋白溶液一侧通过泵加压，可以使两侧溶液在数小时内达到平衡，若增加对蛋白溶液的压力，还可迫使水分和盐更多通过透析膜进入透析液达到对蛋白浓缩的目的。也有出售的脱盐柱，柱内的填料是小孔径的颗粒，蛋白分子不能进入孔内，先于高浓度盐离子从柱中流出，从而使二者分离。蛋白纯化的每一步都会造成目的蛋白的丢失，缓冲液平衡的步骤尤甚。蛋白会结合在任何它能接触的表面上，剪切力、起泡沫和离子强度的快速变化很容易让蛋白失活。 2．3 离子交换色谱这是在所有的蛋白纯化与浓缩方法中最有效方法。基于蛋白与离子交换树脂间的相互电荷作用，通过选择不同的缓冲液，同一种蛋白既可以和阴离子交换树脂（能结合带负电荷的分子）结合，也可以和阳离子交换树脂结合。树脂所用的带电基团有四种：二乙基氨基乙基用于弱的阴离子交换树脂；羧甲基用于弱的阳离子交换树脂；季铵用于强阴离子交换树脂；甲基磺酸酯用于强阳离子交换树脂。蛋白质由氨基酸组成，氨基酸在不同的pH环境中所带总电荷不同。大多数蛋白在生理pH（pH6～8）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端的pH下蛋白会变性失活．应尽量避免。由于在某个特定的pH下不同的蛋白所带电荷数不同，与树脂的结合力也不同，随着缓冲液中盐浓度的增加或pH的变化，蛋白按结合力的强弱被依次洗脱。在工业化生产中更多地是改变盐浓度而不是去改变pH值，因为前者更容易控制。在实验室中几乎总是用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。但在工业生产中盐浓度很难精确控制，所以常用分步洗脱而不足连续升高的盐梯度。与排阻层析相比，离子交换特异性更好，有更多的参数可以调整以获得最优的纯化效果，树脂也比较便宜。值得一提的是，即便是用最精确控制的条件，仅用离子交换单一的方法也得不到纯的蛋白，还需要其他的纯化步骤。
重组蛋白纯化基本策略
捕获阶段：目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白。中度纯化阶段：目标是除去大多数大量杂质，如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等。精制阶段：除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。分离方法的选择根据蛋白质的特殊性质采用不同的分离方法：蛋白质的性质方法电荷（等电点）离子交换（IEX）分子量凝胶过滤（GF）疏水性疏水（HIC）反相（RPC）特异性结合亲和（AC）每一种方法都有分辨率、处理量、速度和回收率之间的平衡。分辨率：由选择的方法和层析介质生成窄峰的能力来实现。总的来说，当杂质和目标蛋白性质相似时，在纯化的最后阶段分辨率是重要因素。处理量：一般指在纯化过程中目标蛋白的上样量。如上样体积、浓度等。速度：在初纯化中是重要因素，此时杂质如蛋白酶必须尽快除去。回收率：随着纯化的进行渐趋重要，因为纯化产物的价值在增加。在三阶段纯化策略中每一种方法的适用性见下表：技术主要特点捕获中度纯化精制样品起始状态样品最终状态IEX高分辨率高容量高速度低离子强度样品体积不限高离子强度或pH改变。样品浓缩HIC 分辨率好容量好高速度高离子强度样品体积不限低离子强度样品浓缩AC高分辨率高容量高速度结合条件特殊样品体积不限洗脱条件特殊样品浓缩GF高分辨率（使用Supedex）样品体积（<总柱体积的5%）和流速范围有限制缓冲液更换（如果需要）样品稀释RPC高分辨率需要有机溶剂在有机溶剂中，有损失生物活性的风险提示：1、通过组和各种方法使纯化步骤之间的样品处理减至最少，以避免需要调节样品。第一个步骤的产物的洗脱条件应适宜于下一个步骤的起始条件。2、硫酸铵沉淀是常用的样品澄清和浓缩方法，所以HIC是捕获阶段的理想方法。3、 GF很适宜在由浓缩效应的方法（IEX、 HIC、 AC）后使用，凝胶过滤对上样体积有限制，但不受缓冲液条件的影响。4、在捕获阶段选择对目标蛋白具有最高选择性或／和处理量的方法5、如果对目标蛋白的性质了解甚少的情况下，可采用IEX-HIC-GF的方法组合作为标准方案。6、只要目标蛋白耐受的情况下，可以考虑采用RPC 方法用于精制阶段。注：应该指出，三阶段纯化策略不是说所有的策略都必须是三个纯化步骤。所用的步骤数目取决于纯度要求和蛋白的最终用途。 蛋白质的蛋白质特性与分离纯化技术的选择 摘要：蛋白质的一级、二级、三级和四级结构决定了它的物理、化学、生物化学、物理化学和生物学性质，综述了不同蛋白质之间的性质存在差异或者改变条件是使之具有差异，利用一种同时多种性质差异，在兼顾收率和纯度的情况下，选择蛋白质提纯的方法。 关键词：蛋白质分离纯化 前言： 蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有成千种不同的蛋白质。蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，到目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来，但对任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯程序来获取高纯度的制品。
分离纯化蛋白质的方法及原理
（二）利用溶解度差别 影响蛋白质溶解度的外部因素有：1、溶液的pH；2、离子强度；3、介电常数；4、温度。但在同一的特定外部条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度。 1、等电点沉淀：原理：蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时，他的溶解度达到最低点。在等电点之上或者之下时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而互相排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时的溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。当pH被调到蛋白质混合物中其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中。这样沉淀出来的蛋白质保持着天然的构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。 5、盐析与盐溶：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水分子之间的相互作用却加强，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子之间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。当溶液的离子强度增加到一定程度时，蛋白质溶解程度开始下降。当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析。盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。此时那些被迫与蛋白质表面的疏水集团接触并掩盖他们的水分子成为下一步最自由的可利用的水分子，因此被移去以溶剂化盐离子，留下暴露出来的疏水基团。蛋白质疏水表面进一步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。 盐析沉淀的蛋白质保持着他的天然构象，能再溶解。盐析的中性盐以硫酸铵为最佳，在水中的溶解度很高，而溶解度的温度系数较低。 3、有机溶剂分级分离法：与水互溶的有机溶剂（甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下有机溶剂会引起蛋白质变性，如果预先将有机溶剂冷却到-40°C以下，然后在不断搅拌下逐滴加入有机溶剂，以防局部浓度过高，那么变性可以得到很大程度缓解。蛋白质在有机溶剂中的溶解度也随温度、pH和离子强度而变化。在一定温度、pH和离子强度条件下，引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，因此控制有机溶剂浓度也可以分
Ni柱亲和层析纯化poly-his变性重组蛋白的标准操作规程
Ni柱亲和层析纯化poly-his变性重组蛋白的标准操作规程（编号：066）1、目的及适用范围 利用Ni2+鳌合层析纯化体外表达的带有His标签的包涵体重组蛋白。 2、主要仪器 超声破碎仪、冷冻离心机、Ni柱、垂直混匀仪 3、主要试剂 3.1 裂解Buffer：50mM Tris，5mM EDTA，0.8%NaCl，pH8.5 3.2 变性剂：6M盐酸胍，2mM EDTA， 50mM Tris，10mM DTT，pH8.5 3.3 Buffer B：8M尿素，0.1M NaH2PO4，10mM Tris，pH8.0 3.4 Buffer C：8M尿素，0.1M NaH2PO4，10mM Tris，pH6.3 3.5 Buffer D：8M尿素，0.1M NaH2PO4，10mM Tris，pH5.9 3.6 Buffer E：8M尿素，0.1M NaH2PO4，10mM Tris，pH 4.5 4、相关的预处理 Ni柱的预处理： 4.1用5个柱体积的无菌水冲洗柱子； 4.2用5个柱体积的0.1M NiSO4冲洗柱子，使柱子挂Ni； 4.3用5个柱体积的无菌水冲洗柱子，除去多余的Ni； 4.4用5个柱体积的酸性Buffer冲洗柱子（使柱子变得疏松）； 4.5用5个柱体积的Buffer B平衡柱子。 5、操作步骤 5.1蛋白的纯化 5.1.1大肠杆菌诱导表达目的蛋白； 5.1.2 4500rpm，离心10-15min，收集菌体； 5.1.3用裂解buffer重悬菌体，8000rpm离心10min，弃上清，收集菌体； 5.1.4 将菌体用裂解buffer重悬，超声破碎菌体； 5.1.5 4℃，12000rpm离心15min，弃上清； 5.1.6 将沉淀用PBST洗涤，4℃，12000rpm离心10min，重复1次； 135
(推荐)蛋白纯化-Ni亲和层析柱法
Ni亲和层析柱法纯化带组氨酸标签的重组蛋白 纯化设备： 纯化仪：?KTA purifier(GE Healthcare, Uppsala, Sweden) Ni亲和层析柱：HisTrap TM HP-5 mL (GE Healthcare, , Uppsala, Sweden) 试剂： 所有上柱的试剂均需经0.2 μM孔径过滤器过滤并超声波震荡除气处理方可使用。 Binding Buffer：20 mM Na2HPO4-NaH2PO4, pH 7.4, 500 mM NaCl, 5 mM 咪唑 Elution Buffer：20 mM Na2HPO4-NaH2PO4, pH 7.4, 500 mM NaCl, 500 mM 咪唑 Stripping Buffer: 20 mM Na2HPO4-NaH2PO4, pH 7.4, 500 mM NaCl, 50 mM EDTA 20%乙醇：200 mL无水乙醇，加蒸馏水定容至1L 0.1M NiSO4: 称取2.6284g NiSO4·6H2O，加蒸馏水溶解，定容至100 mL 操作步骤： 1 样品前处理 取诱导后菌液50 mL，4℃、5000 rpmin离心10 min收集菌体，以25 mL Binding Buffer 重悬菌体，冰浴下超声波破碎至澄清，4℃、12000 rpmin离心25 min，取上清，经0.2 μM 孔径过滤器过滤后待用。 2 Ni柱前处理 上样前，使用10倍柱体积的Binding Buffer以5 mL/min的流速平衡镍柱。 3 上样 经离心、过滤处理后的样品以1 mL/min的流速通过衡流泵加载到平衡后的Ni柱上，收集穿透液，可反复上样以提高样品的挂柱效率。 4 平衡上样后的Ni柱 将已结合目的蛋白的Ni柱回接到?KTA pur ifier上，用10倍柱体积的Binding Buffer 以5 mL/min的流速再次平衡镍柱以去除未结合上的蛋白。 5 梯度洗脱 以梯度的Elution Buffer/Binding Buffer混合液洗脱Ni柱(梯度的界定因蛋白而不同，可经预实验确定)，流速为5 mL/min，并监测OD280值，收集蛋白吸收峰对应的洗脱液
蛋白质的纯化方法
蛋白质的纯化方法 蛋白质在外加电场作用下，带电的蛋白质颗的纯粒在电场中移动的速度(v)取决于化电场强度E，所带的净电荷q，蛋方白质的分子量、分子形状以及与介质法的摩擦系数f。几种常用的电泳纸电泳醋酸纤维薄膜电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE 可分为圆盘电泳和垂直平板电泳) 琼脂糖凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳等电聚焦IEF 双向电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳法电影聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE是利用聚丙烯酰胺凝胶作为支持物的电泳蛋法，聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙稀酰白质胺和交联剂甲叉双丙稀酰胺交联而成的的多孔网状凝胶。纯不连续PAGE有分离胶、浓缩胶和样品化胶。方法 PAGE分辨率很高。电泳过程 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 SDS(十二烷基磺酸钠)是一种阴离子型表面活性剂，它能够与蛋白质多肽蛋链中的氨基酸残基按大约1 比例白结合。质每一个蛋白质分子都因为结合了许多的的SDS而带有大量的负电荷，而蛋白质纯化分子原有的电荷则可以忽略。该法主方要利用了蛋白质分子量大小不同而分法离蛋白质。用已知分子量的蛋白质作为标准，则可以估算出不同蛋白质的分子量。等电聚焦将两性电解质eg:pH3-9，pH5-7同蛋白质样品一起加入到已经灌好的蛋凝胶中，在电场下，两性电解质首白质先达到它的等电点而平衡，蛋白质的样品根据它自身的等电点分别向两纯化极移动，最后也达到平衡。方等电聚焦:这种按等电点的大小，生物法分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为称等电聚焦。等电聚焦的特点就在于它利用了一种称为两性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或其他具有两性电解质性质的样品进行聚焦，从而达到分离、测定和鉴定的目的。蛋白质双向电泳银染结果考马斯亮染色为蓝色连续电泳几种常用的层析法吸附层析分配层析离子交换层析凝胶过滤层析亲和层析柱层析离子交换层析法此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物，将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。蛋离子交换树脂可以分为阳离子交换纤维素白质如羧甲基纤维素CM纤维素)等，阴离子交的换纤维素如二乙基氨基乙基纤维素(DEAE纯纤维素)等。化带正电荷多的蛋白质与纤维素结合较强，而方带正电荷少的蛋白质与纤维素结合则较弱。法用不同浓度的阳离子洗脱液，如NaCl溶液进行梯度洗脱，通过Na的离子交换作用，可以将带有不同正电荷的蛋白质进行分离。离子交换层析法蛋白质的纯化方法凝胶过滤法此法又称为分子筛层析。凝胶过滤所用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或蛋聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠的白内部是多孔的网状结构。质的 Sephadex G10-G200葡聚糖凝胶纯
四种蛋白纯化方式的原理及优缺点的简述
一.分子筛（凝胶层析） 原理：用一般的柱层析方法使相对分子质量不同的溶质通过具有分子筛性质的固定相（凝胶），从而使蛋白质分离。 优点：1.洗脱条件简单，往往只需要一种缓冲溶液，可以使用任何缓冲液。 2.实验操作相对简单 3.条件温和，对蛋白活性保持率高 4.既可以对标签蛋白纯化也可以对非标签蛋白纯化。 缺点：1. 工艺放大困难：分子筛层析无法遵循线性放大原则，即使遵循柱床高度不变的原则，工艺流速如何进行调整，也是需要面临的问题。 2. 层析柱装填困难 3.对上样量有要求 4.测定柱效困难 5.反复使用层析柱困难 二.亲和层析 原理：亲和层析是一种吸附层析，亲和层析利用固相介质中的配基与混合生物分子之间亲和能力不同而进行分离，当蛋白混合液通过层析柱时，与配基能够特异性结合的蛋白质就会被吸附固定在层析柱中，其他的蛋白质对配体不具有特异性的结合能力，将通过柱子洗脱下来，这种结合在一定条件下是可逆的，选用适当的洗脱液，改变缓冲液的离子强度和pH 值或者选择更强的配体结合溶液将结合的蛋白质洗脱下来，而无亲和力的蛋白质最先流出层析柱。 优点:1. 亲和层析法是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。 2. 是最有效的生物活性物质纯化方法，它对生物分子选择性的吸附和分离，可以取得很高的纯化倍数。此外蛋白在纯化过程中得到浓缩，结合到亲和配基后，性质更加稳定，其结果提高了活性回收率。此外它可以减少纯化步骤，缩短纯化时间，对不稳定蛋白的纯化十分有利。 缺点：1.除特异性的吸附外，仍然会因分子的错误认别和分子间非选择性的作用力而吸附一些杂蛋白质，另洗脱过程中的配体不可避免的脱落进入分离体系。 2. 载体较昂贵，机械强度低，配基制备困难，有的配基本身要经过分离纯化，配基与载体耦联条件激烈等。 三.离子交换层析 原理：离子交换层析根据样品表面电荷不同进行分离纯化的技术，根据不同蛋白样品在同一Ph条件下所带电荷正负以及带电荷量不同而将不同蛋白样品分离。 适用范围：适合任何带点生物分子的初步纯化，除去杂质和提纯。 优点：1.领域宽：适合任何带点生物分子的分离（蛋白，多肽，核酸，多糖） 2.高分辨率：只有一个氨基酸区别的样品也可以分离。 3.经过洗脱后可以重复使用层析柱。 4.有亲水性，对大分子吸附性不强，温和条件可洗脱，蛋白质不易变性 缺点：1.定性能力较差 四.高效液相层析 原理：储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相）内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别。适用范围：高效液相色谱更适宜于分离、分析高沸点、热稳定性差、有生理活性及相对分子
Ni柱亲和层析纯化poly-his可溶性重组蛋白的标准操作规程
Ni柱亲和层析纯化poly-his可溶性重组蛋白的标准操作规程（编号：067）1、目的及适用范围 利用Ni2+鳌合层析纯化体外表达的带有His标签的可溶性重组蛋白。 2、主要仪器 Ni柱、真空抽滤泵、超声破碎仪、冷冻离心机 3、主要试剂 3.1磷酸盐体系 Binding buffer：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，10 mM imidazole，pH 8.0； Wash Buffer：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，20 mM imidazole，pH 8.0； Elute Buffer：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，500 mM imidazole，pH 8.0。 3.2 Tris盐体系 Binding buffer：20mM Tris，500 mM NaCl，20 mM imidazole，pH8.0； Wash Buffer：20mM Tris，500 mM NaCl，60 mM imidazole，pH8.0； Elution Buffer：20mM Tris，500 mM NaCl，500 mM imidazole，pH8.0； Striping Buffer：20mM Tris，100mM EDTA，500mM NaCl，pH8.0。 酸性Buffer：20mM 醋酸钠，500mM NaCl，pH4.0。 Charge Buffer：0.1M NiSO4 4、操作步骤 4.1 Ni柱的预处理 4.1.1用5个柱体积的无菌水冲洗柱子； 4.1.2用5个柱体积的0.1M NiSO4冲洗柱子，使柱子挂Ni； 4.1.3用5个柱体积的无菌水冲洗柱子，除去多余的Ni； 4.1.4用5个柱体积的酸性Buffer冲洗柱子（使柱子变得疏松）； 4.1.5用5个柱体积的Binding Buffer平衡柱子。 4.2蛋白的纯化 4.2.1大肠杆菌诱导表达目的蛋白； 4.2.2 4500rpm，离心10-15min，弃上清，收集菌体； 4.2.3 将收集的菌体用Binding buffer重悬，8000rpm离心10min，弃上清，收集菌体； 137