5_葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质

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葡聚糖层析实验报告

一、实验目的1. 掌握葡聚糖凝胶层析的原理及其在生物大分子分离中的应用。

2. 学习并掌握葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。

3. 通过实验，验证葡聚糖凝胶层析对分子量不同的物质具有分离效果。

二、实验原理凝胶层析，又称分子排阻层析或凝胶过滤，是一种基于被分离物质分子量差异的层析分离技术。

该技术利用凝胶颗粒的多孔网状结构，通过分子量差异使不同组分在层析柱中以不同的速度移动，从而达到分离的目的。

葡聚糖凝胶是一种由直链的葡聚糖分子和交联剂3-氯1，2-环氧丙烷交联而成的高分子化合物。

通过调节葡聚糖和交联剂的比例，可以控制凝胶颗粒的孔径大小。

分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随溶剂流动快速流出层析柱；而分子量小的物质可进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程慢，后流出层析柱。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 葡聚糖凝胶（Sephadex）- 标准蛋白质溶液（如牛血清白蛋白、鸡蛋清蛋白等）- 溶剂（如磷酸盐缓冲溶液）- 离心机- 层析柱- 漏斗- 吸管2. 实验仪器：- 电子天平- 移液器- 显微镜四、实验步骤1. 准备层析柱：将葡聚糖凝胶倒入层析柱中，用溶剂冲洗，直至凝胶床均匀。

2. 加载样品：将标准蛋白质溶液加入层析柱中，使其在凝胶床表面形成一薄层。

3. 洗脱：用溶剂缓慢冲洗层析柱，收集不同时间流出的洗脱液。

4. 分析洗脱液：将收集到的洗脱液进行比色分析或电泳分析，确定各组分的位置。

五、实验结果与分析1. 实验结果：- 洗脱液在比色分析或电泳分析中，可观察到不同分子量的蛋白质分别在凝胶层析柱中的位置。

- 小分子量的蛋白质先流出层析柱，大分子量的蛋白质后流出。

2. 结果分析：- 通过实验，验证了葡聚糖凝胶层析对分子量不同的物质具有分离效果。

- 实验结果表明，小分子量的蛋白质在凝胶层析柱中的流动速度较快，大分子量的蛋白质流动速度较慢。

六、实验结论1. 葡聚糖凝胶层析是一种基于分子量差异的层析分离技术，在生物大分子分离中具有广泛的应用。

血浆清蛋白的分离纯化与鉴定实验原理不同的蛋白质的分子量

血浆清蛋白的分离纯化与鉴定实验原理不同的蛋白质的分子量、溶解度、以及在一定条件下带电的情况有所不同，可以更据这些性质的差别，分离及提纯各种蛋白质。

利用硫酸铵分段盐析法将血清中的清蛋白及球蛋白分离，清蛋白液再利用葡聚糖凝胶过滤法除盐，即可得到较纯的清蛋白。

纯化后的清蛋白可利用醋酸纤维薄膜电泳法鉴定其纯度。

盐析：是指将中性盐（如硫酸铵）加入蛋白质溶液中，中和Pr蛋白质表面电荷及破坏水化膜，使蛋白质相互聚集在析出。

分段盐析：各种蛋白质盐析时所需的盐浓度和PH不同，利用不同盐浓度下Pr溶解度不同，将蛋白质分段沉淀下来。

半饱和硫酸铵沉淀血清中球蛋白（清蛋白溶解）将血清清蛋白和球蛋白初步分离。

常用的除盐方法：半透膜透析；凝胶过滤（层析）。

在葡聚糖凝胶层析柱中，由于蛋白质和盐的分子量不同，洗脱速度也不同，大分子蛋白质不能进入凝胶的网孔内而先流出，小分子盐则可进入网孔滞留在凝胶内，收集蛋白洗脱液，即可得到脱盐的蛋白质。

用三氯醋酸液鉴定洗脱的蛋白液，以BaCL2检测硫酸铵。

纯化后的清蛋白用醋酸纤维薄膜电泳鉴定蛋白质分离效果。

实验试剂1．饱和硫酸溶液：称固体硫酸铵85g于100ml蒸馏水中，在70～80℃水浴中搅拌溶解，用浓氨水调PH为7.2，室温放置过夜，瓶底析出白色结晶，上层液即为饱和硫酸铵液。

2．生理盐水：称取分析纯NaCl 0.89克，蒸馏水稀释至1000ml.3．葡聚糖凝胶Sephadex G-25: 称取10克Sephadex G-25，加入200ml 0.02mol/lPH6.5磷酸盐缓冲液溶胀24小时。

4．10％三氯醋酸。

5．1％氯化钡溶液6．pH8.6，离子强度0.06巴比妥电极缓冲液：称取巴比妥钠12.76g，巴比妥1.66g，蒸馏水加热溶解后再加水至1000ml。

7．氨基黑10B染色液：称取氨基黑10B 0.5g，用甲醇50ml，冰醋酸10ml，蒸馏水40ml 溶解。

8．漂洗液：95％乙醇45ml，加冰醋酸5ml及蒸馏水50ml。

5 葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质

方法性质亲和层析对配体分子的亲和力吸附层析吸附性质电泳离子交换层析等电荷等电点沉淀盐析有机溶剂沉淀等溶解度透析超滤密度梯度离心凝胶层析等分子大小凝胶层析的基本原理分子大于凝胶孔隙范围的物质
葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质
教学目标
了解：层析技术的基本原理;
有效分配系数Kav的计算。
理解：葡聚糖凝胶的选择和准备。掌握：凝胶层析的原理和操作方法;
积Ve有关：
Kav = （Ve — Vo）/（Vt — Vo）
Vt和Vo恒定，Ve随分离物分子量的变化而变化
？思考：为什么分离物分子量越大Kav值越小
葡聚糖凝胶柱层析法的特点
天然凝胶：一些糖类物质，如淀粉、琼脂及琼脂糖等。人工合成凝胶：葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两大类。
葡聚糖凝胶（Sephadex）：由许多右旋葡萄糖单位通过 1，6-糖苷键联结成链状结构，再由交联剂交联形成不溶水的多孔网状高分子化合物。
溶解度等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀等
电荷电泳、离子交换层析等
吸附性质吸附层析
对配体分子亲和层析的亲和力
凝胶层析的基本原理
凝胶层析（又叫分子筛层析或排阻层析）指混合物随流动相经过装有凝胶作为固定相的层析柱时，各组分因分子大小不同而被分离的技术。
凝胶层析的过程
凝胶层析过程的数理关系
适用范围
脱盐、小肽等低分子量蛋白、多肽中、低分子量蛋白、多肽中、高分子量蛋白高分子量蛋白
X：① 交联度。X越小，交联度越大，网孔越小，适用于分离低分子量产品。反之亦然。
② 吸水量。G-25表示：1g干胶吸水2.5mL，依次类推。
• 本实验中用Sephadex G 50（分离分子量范围 1500~20000），以蒸馏水为洗脱剂。

实验三葡聚糖凝胶柱层析纯化蛋白质课件

实验三葡聚糖凝胶柱层析纯化蛋白质课件
目录
• 实验原理 • 实验材料与设备 • 实验步骤 • 结果分析与讨论 • 注意事项与安全
01
实验原理
葡聚糖凝胶柱层析的原理
葡聚糖凝胶是一种具有三维网络结构的凝胶，具有良好的机械强度和化学稳定性。它可以通过改变凝胶孔径的大小来分离不同大小的分子。
当混合物溶液通过葡聚糖凝胶柱时，分子量较小的物质可以进入凝胶孔内，而分子量较大的物质则被排阻在外。随着流动相的流动，分子量小的物质逐渐被冲出凝胶柱，而分子量大的物质则被滞留在凝胶柱内或缓慢流出。
结果的讨论与优化
结果讨论
根据实验结果，讨论凝胶柱层析纯化蛋白质的效果，分析可能影响分离效果和蛋白质纯度的因素，如凝胶柱的填装、洗脱液的组成和洗脱速度等。
结果优化
根据结果讨论，提出优化实验条件的建议，如改变凝胶柱的填装方式、调整洗脱液的组成或改变洗脱速度等，以提高蛋白质的分离效果和纯度。
05
注意事项与安全
分离度的计算
分离度是相邻两个峰之间的距离与峰宽的比值，可以通过测量洗脱液中蛋白质的浓度变化来计算。
03
回收率的计算
回收率是纯化后蛋白质的质量与纯化前蛋白质的质量的比值，可以通过
称重法或紫外吸收法来测量。
蛋白质纯度的检测
检测方法：蛋白质纯度的检测方法包括电泳法、质谱法、免疫学检测法和光谱分析法等。电泳法是最常用的方法之一，可以通过观察电泳图谱来判断蛋白质的纯度。
电泳图谱的分析：电泳图谱中，单一的、清晰的条带表明蛋白质纯度较高；而模糊的、多条带则表明蛋白质中含有杂质。
纯度标准：蛋白质纯度标准通常由国际蛋白质协会制定，分为一级、二级和三级纯度标准。一级纯度标准要求蛋白质中仅含有一种单体蛋白质，不含有其他杂质；二级纯度标准要求蛋白质中主要含有一种单体蛋白质，其他杂质含量不得超过5%；三级纯度标准要求蛋白质中主要含有一种单体蛋白质，其他杂质含量不得超过10%。

交联葡聚糖凝胶层析分离纯化蛋白质原理

交联葡聚糖凝胶层析分离纯化蛋白质原理下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。

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实验三葡聚糖凝胶柱层析纯化蛋白质

层析柱的重要参数：
Vt(total volume) Vo(outer volume) Vi(inner volume) Ve(elution volume) Vg(gel volume) Vt=Vo+Vi+Vg , Ve=Vo+Kd×Vi。
组分的洗脱体积（Ve）：①当样品的体积很少时（与洗脱体积比较可以忽略不计），在洗脱图中，从加样到峰顶位置所用洗脱液体积为Ve。 ②当样品体积与洗脱体积比较不能忽略时，洗脱体积计算可以从样品体积的一半到峰顶位置。③当样品体积很大时，洗脱体积计算可以从应用样品开始到洗脱峰升高的弯曲点（或半高处）。
常用0.02％叠氮钠或20%乙醇溶液作防腐剂。 1 厘米光程时， 254nm 处透光率为 60 ％，
280nm处透光率为100％。
3、试剂、器材：
3.1、层析介质 Sephadex G-50； 3.2、样品（包含三个组分）： ①蓝色葡聚糖2000， ②溶菌酶，③ Trp
上样量：0.4ml/柱。 3.3、洗脱液：0.15M氯化钠，即生理盐水。
、洗脱液流速的影响：
洗脱液的流速与样品分离的分辨率相关。流速过快，会使色谱峰变形，流速过慢，样品扩散倾向加剧。一般流速控制在30－200ml/h。
今天洗脱流速控制在1ml/min。
、洗脱液的离子强度和pH值的影响：
纯化蛋白时,通常选用离子强度＞0.02的盐溶液作洗脱剂，以增加样品的溶解度和消除凝胶的吸附作用；
Kd是分配系数：用于衡量两个物质的分离分辩率，是凝胶层析的一个特征常数，只与被分离物质分子大小和凝胶孔径大小有关，与层析柱的长短粗细无关。
Kd值的计算：Kd=(Ve-Vo)/Vi

凝胶柱色谱分离蛋白质

3、各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。操作过程中，色谱柱内液面不断下降，则表示整个系统有漏气之处，应仔细检查并加以纠正。 4、始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变差，不得不重新装柱。 5、洗脱用的液体应与凝胶溶胀所用液体相同，否则，由于更换溶剂引起凝胶容积变化，从而影响分离效果
【思考题】 1、凝胶色谱分离有何特点和主要用途？ 2、做好本实验的关键事项主要有哪些？ 3、本实验中出现几个洗脱峰？哪个是溶菌酶的洗脱峰?
而小分子物质能够扩散进入凝胶颗粒的微孔中因此在流动过程中不断地进出于胶粒的微孔这样就使小分子物质向下移动的速度落后于大分子物质从而使溶液中的各组分按分子量从大到小的顺序先后流出色谱柱达到分离纯化的目的
凝胶柱色谱分离蛋白质
【目的要求】 1、熟悉凝胶色谱分离的基本原理； 2、掌握凝胶柱色谱填充物的装柱、平衡、加样、洗脱等基本操作技术。

2、平衡：用0.025MKCl-0.2M乙酸缓冲液流动平衡凝胶色谱柱。开始时，流速控制在低于0.5mL/min，在平衡过程中逐渐增加到色谱时的速度即3~4mL/5min，一般用约 2~3倍总床体积的缓冲溶液流过柱即可平衡。

3、加样：吸去柱床表面以上的溶液，面上留下一些液体从柱的出口流出。等到凝胶床面上的液体正好流干时，小心地用滴管将约1mL蓝色葡聚糖和溶菌酶的混合液加到凝胶床面上。先使滴管尖端接触离柱床表面约1cm高处的内壁，随加随沿柱内壁转动一周，然后迅速移至中央，使样品尽可能快地覆盖住全胶面，打开下口，以便使样品均匀地渗入柱内，当样品液下降至与胶面相平（胶面必须覆盖一层薄薄的溶液）时，关闭下口。待其正好流干时再加少量缓冲溶液，这样滴入洗脱液时不会冲动凝胶床面。加样前，如果胶面不平整，可用玻棒将胶表层轻轻搅起，待其自然沉降至平整后，方可加样，加样过程中注意不要破坏胶面的平整。

05 实验五葡聚糖凝胶层析

实验五. 葡聚糖凝胶层析【实验目的】1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。

2．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。

【实验原理】凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤，是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术，这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法。

层析的固定相载体是凝胶颗粒，目前应用较广的是：具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）。

葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3—氯1，2—环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。

凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制，交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松，网孔的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。

可分离的分子量范围从几百到几十万不等。

葡聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。

分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。

若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间，则在两者之间从柱中流出，由此就可以达到分离目的。

本实验以葡聚糖凝胶G—25作为固定相载体，来分离蓝色葡聚糖—2000和溴酚蓝。

蓝色葡聚糖—2000分子量接近2×106，而溴酚蓝分子量为670，二者分子量相差较大，前者完全排阻，而后者则可完全进入凝胶颗粒网孔内，二者通过层析柱的时间不同而分开。

【实验材料】1.实验器材层析柱(1×20cm)附有一小段乳胶管及螺旋夹；洗脱液瓶(带下口的三角瓶，250m1)；试管及试管架；量筒10m1；721型分光光度计2.实验试剂(1) Tris—醋酸缓冲液(pH7.0):取0.0lmol/L Tris溶液(含0.1mol/L KCl)900m l，用浓醋酸调pH至7.0，加蒸馏水至1000m1。

蛋白FITC标记及葡聚糖凝胶柱使用

蛋白FITC标记及葡聚糖凝胶柱使用一、蛋白FITC标记1. 准备FITC溶液：将FITC溶解在适量的溶剂中（如PBS缓冲液），使其浓度为1 mg/ml。

2. 准备蛋白溶液：将待标记的蛋白溶解在PBS缓冲液中，使其浓度为1 mg/ml。

3. 将FITC溶液加入蛋白溶液中：将适量的FITC溶液加入蛋白溶液中，使其FITC蛋白的浓度为10 μg/ml。

溶液要充分混合，可以轻轻摇晃或使用旋转器。

4.反应：将反应溶液在室温下孵育30分钟至1小时。

反应时间可以根据实验需要进行调整。

5.停止反应：将反应溶液加入适量的停止溶液中，如甘氨酸溶液。

停止溶液可以中和未反应的FITC，并保护标记的蛋白不被降解。

6.蛋白FITC标记的纯化：可以通过蛋白层析或其他纯化方法将蛋白FITC标记纯化。

葡聚糖凝胶柱是一种常用的蛋白层析方法，用于分离和纯化蛋白。

1.准备葡聚糖凝胶柱：将葡聚糖凝胶柱放入层析柱中，并用适量的缓冲液（如PBS）均匀填充柱内。

2.样品加载：将待分离的蛋白样品加入层析柱中，样品可以预先进行适当的处理，如去除杂质、调整pH值等。

3.缓冲液洗脱：通过加入适量的缓冲液（如PBS），将未结合的蛋白从凝胶柱中洗脱。

可以通过监测洗脱液的吸光度或测定蛋白浓度来确定洗脱的程度。

4.目标蛋白洗脱：通过加入适量的洗脱缓冲液（如含有高浓度盐的缓冲液），将目标蛋白从凝胶柱中洗脱。

可以根据实验需要选择不同的洗脱条件，如改变盐浓度、改变pH值等。

5.纯化目标蛋白：通过收集洗脱的蛋白样品，可以进行进一步的纯化步骤，如使用其他层析方法、电泳等。

葡聚糖凝胶柱的使用可以根据实验需要进行调整，如选择不同的凝胶柱大小、调整缓冲液成分和流速等。

通过葡聚糖凝胶柱的分离和纯化，可以获得纯度较高的蛋白样品，用于后续的实验分析。

总结：蛋白FITC标记和葡聚糖凝胶柱使用是常见的蛋白实验技术。

蛋白FITC标记可以用于检测蛋白的位置和定量，通过将FITC与蛋白共价结合。

凝胶过滤法使蛋白质脱盐

实验步骤
1 溶胀凝胶：用去离子水浸泡Sephadex G-25凝胶24h以
上或用去离子水沸水浴溶胀约2h。 2 凝胶装柱：将溶胀的凝胶轻缓倒入柱中，使其自然沉降，沉降后凝胶柱的高度为柱高的3/4~4/5切柱床面平整，床面维持0.5cm高的洗脱液。 3 洗柱：除杂，一般洗脱液体积为柱床体积的2~3倍。 4 加样洗脱：取0.5mL的样品，取样器尖头沿管壁伸到床面之上，慢慢将样品加到凝胶床面上。拧松夹子，待样品全部进入凝胶柱中，接通洗脱液，开始洗脱并收集洗脱液。
2 加入样品时应注意不要搅动床面，使样品与床面的洗拖脱液混合，影响分离效果。
5 收集检测：用1.5mL离心管收集洗脱液，每管收集1mL。边收集边进行蛋白质与铵盐的检测。取洗脱液2滴置于小试管中，加入磺柳酸1滴，
如有蛋白质洗脱下来，则有白色混浊或沉淀出现。取洗脱液2滴加入白瓷板中，加入纳氏试剂1滴，如有铵盐洗脱下来，则有黄红色沉淀。
注意事项
1 装柱时，凝胶中的水不宜过多，用玻棒搅动小烧杯中的凝胶，轻缓倒入柱中，凝胶的高度应是层析柱高度的3/4~4/5。如层析柱中凝胶高度不够，应在凝胶床面未形成之前再加入葡聚糖凝胶，要尽量防止由于加胶次数较多，致使胶中出现节痕。同时，要避免柱床内产生气泡。
凝胶过滤法使蛋白质脱盐
实验目的
学习凝胶过滤法分离纯化物质的原理与操作技术。
实验原理
葡聚糖凝胶（Sephadex G-25）具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排阻在外部，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同相对分子量被分开。
葡聚糖凝胶是葡萄糖通过α-1，6-糖苷键形成的葡聚糖长链，与交联剂环氧氯丙烷以醚键相互交联而成的具有三维结构的多孔网状结构物。

葡聚糖凝胶柱层析

THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
外。
亲水性
葡聚糖凝胶是一种亲水性凝胶，在水中能够膨胀并保持稳定的结构。
分子筛作用
由于凝胶的网孔大小不同，不同大小的分子在通过凝胶柱时的路径和速度也不同，从而实现分子的分离。
柱层析分离原理
吸附与解吸
样品中的各组分在葡聚糖凝胶上的吸附能力不同，通过选择合适的洗脱液，可以实现各组分的分
离。
分子筛效应
4. 上样
5. 洗脱与收集
将待分离样品溶解在少量洗脱液中，沿柱内壁缓慢加入，避免冲击凝胶表面。
开启恒流泵，以恒定流速进行洗脱，同时用收集器按一定时间或体积收集流出液。
6. 检测与记录
7. 结果分析
对收集到的流出液进行适当稀释后，利用紫外可见分光光度计或酶标仪等检测目标物质的含量，并记录数据。
优点
分辨率高，操作简便，重复性好，对样品的适用范围广。
缺点
对于某些非水溶性物质或极端条件下的分离效果不佳，且分离过程中可能存在吸附损失。
02 实验材料与方法
主要试剂与仪器
主要试剂
葡聚糖凝胶（如Sephadex G-25 、G-50、G-100等）、洗脱液（一般为缓冲液或盐水）、待分离样品。
基本原理 • 实验材料与方法 • 葡聚糖凝胶柱层析在生物大分子分离中应
用 • 葡聚糖凝胶柱层析在药物分析中应用 • 葡聚糖凝胶柱层析在环境科学中应用 • 实验结果分析与讨论
01 葡聚糖凝胶柱层析基本原理
葡聚糖凝胶结构与性质
三维网状结构
葡聚糖凝胶具有三维的交联网状结构，这种结构允许小分子进入凝胶内部，而大分子则被排除在
环境污染物检测与去除

实验五葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质ppt课件

经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用
教学目标:
❖了解：
1. 层析技术的基本原理。 2. 有效分配系数Kav的计算。
❖理解：
葡聚糖凝胶的选择和准备。
❖掌握：
1. 凝胶层析的原理和操作方法。 2. 有效分配系数Kav的意义。
❖ 较小的分子则可以渗透进入凝胶颗粒内部，然后再扩散出来，经历的流程长，流动速度慢，后流出。
经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用
凝胶层析的数理关系
外水体积Vo 凝胶体积Vg
四、样品收集
1. 样品一旦加入柱床面后马上用烧杯收集流出液，（注意柱床上要不断加水，保持1cm高水层）直到两种蛋白全部洗脱。
2. 倒出凝胶，清洗层析柱。
经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用
使用教材：
《生物化学与分子生物学实验技术》，杨安钢主编，高等教育出版社，2008年第1版
参考资料：
《生物化学》，贾弘褆主编，人卫出版社，2005 年第1版
推荐网站：
1. 第三军医大学生物化学与分子生物学教研室： http://192.168.4.133:8002/
2. 美国国立生物技术信息中心：
☻葡聚糖凝胶（Sephadex）
G型（G-X: X数字代表 LH型交联度与吸水量）
☻聚丙稀酰胺凝胶（Polyacrylamide）

葡聚糖凝胶层析实验报告

葡聚糖凝胶层析实验报告一、实验目的1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理；2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层析的操作技术。

二、实验原理凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。

对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。

分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。

一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。

这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。

三、仪器、材料和试剂1、仪器：内直径为1cm，外直径为1.5cm的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。

2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。

四、实验步骤1、装柱将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。

2、上样装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。

3、洗脱和收集打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层析柱中加入3-4ml的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱收集。

4、样品的检测收集一段时间后，将样品取出，依次编号，依次加入200μl到酶标版上，选用一个孔加入双蒸水作为对照，用酶标仪在280nm下测检测。

五、实验结果及分析1、实验结果：序号 2 4 6 8 10 12 14吸光0．051 0.045 0.051 0.071 0.195 0.127 0.067 度A序号16 8吸光0.055 0.039 0.066 0.027 0.053 0.049 0.011度A2、蛋白质样品洗脱曲线：收集样品时设置的时间为3min每管，收集得到每管的体积为1.4ml，则计算：流速=每管体积/每管时间=1.4/3=0.47ml/min。

葡聚糖凝胶使用说明书

上课下子棋保证书详细(第一篇)此文档协议是通用版本，可以直接使用，符号*表示空白。

敬重的班主任老师：在此，非常愧疚地向你递交我这份保证，由于一次保证意味着我犯了一次重大过错。

此次，我由于上课玩五子棋、不好好听课，给班级上课秩序造成了比较严峻的影响。

您观看到我的不良行为，准时加以制止，并且没收我的手机作为惩罚。

如今，经过面壁思过与深刻反剩我深深地觉悟到自己所犯错误的严峻性：第一，我身为一名在校同学，学习无疑是自己的本职工作，也是必需履行的义务。

其次，在高校期间的教育对于每个人来说都是非常宝贵的，而我却不思进取，甚至严峻到在上课期间玩手机、不用心听课。

这更是犯了非常严峻的错误，这是对于教育资源的铺张。

第三，身为一名同学，我犯这样的错误，无疑是大大辜负了我父母对我的殷切期望。

这对于我年迈的父母来说，是一个很大的打击。

我的父母辛苦赚钱，送我们进入高校深造，为的就是我们能够努力学习，找到一份好的工作，将来能够生活得更好。

而为的使我们能够在各方面活动好的条件，父母为我们购得手机。

而我却恰恰不用功读书，不能全身心的投入学习，反倒是上课玩五子棋。

如今我做了错事，辜负了我的父母，我觉得很惭愧，想起父母的辛苦，不由地流泪。

再看我的。

错误，我也是很抱歉辛勤教育我的老师的。

老师为我们辛勤工作，为我们努力备课，而我却辜负老师的辛苦，上课不好好听讲是对老师的不敬重。

此次保证过后，我也会跟老师做当面正式赔礼的。

最终我写一下对今后保证：我保证今后上课期间不做任何**行为了，上课期间不再玩五子棋。

今后仔细听每一节课，在校当一名好同学，在家做一个孝顺的儿子，将来为社会做出自己的一份贡献。

此致敬礼！保证人：******日期：*****上课下子棋保证书详细(第二篇)合同范本合同编号：[合同编号]标题：上课下子棋保证书日期：[签署日期]甲方：[甲方机构/个人名称]地址：[甲方地址]电话：[甲方电话]乙方：[乙方机构/个人名称]地址：[乙方地址]电话：[乙方电话]鉴于甲方作为[甲方机构/个人名称]（以下简称“甲方”）提供上课下子棋服务，乙方作为[乙方机构/个人名称]（以下简称“乙方”）接受上述服务，双方达成以下协议，以兹共同遵守：一、合作内容1.1 甲方将为乙方提供专业的上课下子棋服务，包括但不限于教授棋谱、指导棋局策略等。

葡聚糖凝胶柱使用及注意事项

葡聚糖凝胶柱使用及注意事项葡聚糖凝胶柱是一种常用的色谱柱，其主要由多糖聚合物构成，具有多孔结构以及极高的比表面积。

葡聚糖凝胶柱在生物分离、蛋白质纯化以及分析等方面有重要的应用。

下面将介绍葡聚糖凝胶柱的使用方法以及注意事项，并列举了几种常见溶剂的溶胀系数作为参考。

使用方法：1.预处理：新柱使用前需进行预处理。

首先，在使用前用适当的缓冲液再生柱子，一般推荐使用PBS缓冲液进行再生。

其次，用去离子水进行洗脱，去除缓冲液中的离子。

2.样品准备：准备好带有样品的溶液，可以是蛋白质溶液、核酸溶液或者其他需要分离的溶液。

3.进样：将样品溶液注入到柱子中，可以使用曲线尖管或者注射器进行。

4.溶剂流动：使用适当的流动缓冲液进行柱子的着色，常用的缓冲液有PBS缓冲液、甲醇和乙醇。

5.收集分离的组分：通过收集分离的组分，可以进行后续的实验操作或者分析。

注意事项：1.柱子的平衡：在使用柱子前，将柱子放入合适的缓冲液中，进行平衡处理，通常需要约30分钟。

2.柱子的保管：使用完毕后，需将柱子用适当的缓冲液保存，避免干燥。

3.柱子的温度：柱子的运行温度一般在室温下进行，避免过高温度的使用，以免影响柱子的性能。

4.溶液选择：在选择适当的缓冲液时，应根据样品的性质以及需求进行选择，不同的缓冲液对分离的效果会有影响。

5.柱子的清洗：使用完毕后的柱子需要进行彻底的清洗工作，尤其是对于经常使用的柱子，清洗工作要做得彻底。

下面是几种常见溶剂的溶胀系数参考值：1.水：溶胀系数为1，对于葡聚糖凝胶柱来说，水是适用的溶剂。

2.硫酸：溶胀系数为0.57，硫酸能够完全渗透葡聚糖凝胶柱。

3.乙醇：溶胀系数为0.44，适量的乙醇可以使用，但过高浓度的乙醇可能会影响柱子的性能。

4.甲醇：溶胀系数为0.65，甲醇也可以使用，但同样需要注意控制浓度。

总结：葡聚糖凝胶柱是一种常见的色谱柱，具有广泛的应用。

在使用葡聚糖凝胶柱时，需进行适当的处理以及注意事项，以保证柱子的性能和寿命。

凝胶层析生化实验报告

一、实验目的
1. 了解凝胶层析的原理和方法。
2. 掌握凝胶层析的操作技能。
3. 通过凝胶层析分离和纯化蛋白质。
二、实验原理
凝胶层析是一种基于分子大小差异的分离技术，其原理是利用凝胶的多孔性，使不同大小的分子在凝胶柱中以不同的速度移动，从而实现分离。凝胶层析可分为凝胶过滤和凝胶排阻两种类型，其中凝胶过滤适用于分离分子量相近的物质，凝胶排阻适用于分离分子量差异较大的物质。
本实验采用凝胶过滤法，以葡聚糖凝胶为固定相，通过凝胶柱对蛋白质混合物进行分离。
三、实验材料
1. 蛋白质混合物：含有多种蛋白质的溶液。
2. 葡聚糖凝胶磷酸盐缓冲液（pH 7.4）。
4. 其他：层析柱、恒流泵、紫外分光光度计、收集器等。
四、实验步骤
1. 准备凝胶柱：将葡聚糖凝胶加入层析柱中，使其自然沉降至底部，形成凝胶床。
3. 本实验中，蛋白质分子量分布较广，说明蛋白质混合物中存在多种分子量的蛋白质。通过凝胶层析，可以将这些蛋白质分离和纯化。
七、实验总结
本实验通过凝胶层析分离和纯化了蛋白质混合物，成功实现了蛋白质的分离和纯化。通过实验，掌握了凝胶层析的原理和操作技能，为今后的实验研究奠定了基础。
六、实验讨论
1. 凝胶层析的分离效果受多种因素影响，如凝胶的种类、洗脱液的pH、流速等。在本实验中，选用Sephadex G-100凝胶，以磷酸盐缓冲液（pH 7.4）为洗脱液，流速为1.0 mL/min，可得到较好的分离效果。
2. 凝胶层析具有操作简单、分离效果好、不影响蛋白质活性等优点，在蛋白质分离和纯化中具有广泛的应用。
五、实验结果与分析
1. 洗脱曲线：随着洗脱的进行，蛋白质分子量逐渐增大，洗脱峰的位置逐渐向后推移。根据洗脱峰的位置，可以判断蛋白质的分子量。