5_葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质

凝胶层析的实际操作
4、上样 上样体积不大于6%柱床体积，上样浓度控制再35mg / ml~50 mg / ml， 以不大于12cm / h线性流速上样。
5、洗脱 用0.05mol / L NaCl-5mmol / L PB溶液，以不大于12cm / h线性流速洗脱
凝胶层析的操作注意事项
1、盐源自文库过程盐溶液加少，盐析程度不够；盐溶液加多，盐 浓度过高有可能会导致蛋白变性； 2、蛋白的上样浓度不宜过高（70 mg / ml GE公司凝胶手册 数据 ），否则样品粘稠影响分离效果； 3、样品必须是均匀的溶液体系，没有颗粒，否则容易造成 柱子阻塞；
凝胶层析的分配系数
* 分配系数Kav：表示任何一种被分离的化合物被
凝胶排阻的程度。
* Kav与凝胶柱的总体积Vt、外水体积Vo、洗脱体
积Ve有关： Kav = （Ve — Vo）/（Vt — Vo）
Vt和Vo恒定，Ve随分离物分子量的变化而变化 ， 分离物分子量越大Kav值越小
葡聚糖凝胶柱层析法的特点
X：① 交联度。X越小，交联度越大，网孔越小，适用于分离低分子 量产品。反之亦然。
② 吸水量。G-25表示：1g干胶吸水2.5mL，依次类推。
葡聚糖凝胶柱层析法的特点
聚丙烯酰胺葡聚糖（Sephacryl）：烯丙基葡聚糖和N,N亚甲双丙烯酰胺的交联共聚物
型号：S-100,S-200,S-300,S-400等
Sephacryl的常见规格（分级范围）
预装柱
车间现有规格 1000~100000
凝胶层析的实际操作
1、样品准备 1.1、根据Phenyl下样合格样品的体积，加入3.5 mol / L (NH4)2SO4溶液， 使样品中(NH4)2SO4溶液浓度稀释到1.35~1.83mol / L。置于层析柜中10 min以上。4℃，6500 rpm离心30 min，收集沉淀。用pH 7.2士0.1的 5mol / L PB溶解沉淀，完全溶解后，4℃，6500 rpm离心15分钟，取上 清。
天然凝胶：一些糖类物质，如淀粉、琼脂及琼脂糖等。 人工合成凝胶：葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两大类。
葡聚糖凝胶（Sephadex）：由许多右旋葡萄糖单位通过 1，6-糖苷键联结成链状结构，再由交联剂交联形成不溶 水的多孔网状高分子化合物。
型号：G200、 G150、 G100、 G75、 G50、 G25、 G15
2、前处理 2.1、0.5mol / L NaOH以22cm/h线性流速冲1.5%的柱床体积，再用注射 用水冲中性
3、平衡 3.1先用4L200 mmol / L PB以22cm/h线性流速平衡 3.2再用0.05mol / L NaCl-5mmol / L PB以22cm/h线性流速平衡层析柱， 不时检测出液端穿液电导和pH，如果与平衡液的电导和pH一致，表明 层析柱已经平衡好。
凝胶柱层析 分离纯化蛋白质
学习目的
了解：层析技术的基本原理;
有效分配系数Kav的计算。
理解：凝胶的选择和准备。 掌握：凝胶层析的原理和操作方法;
有效分配系数Kav的意义。
重点：
1、凝胶层析的原理和实际操作步骤。
2、分配系数与被分离分子量之间的关系。
蛋白质的分离纯化
蛋白质分离纯化的方法很多，主要是根据蛋白分子之间 特异性的差异，如分子大小，溶解度，电荷等建立起来的。
性质
方法
分子大小 透析、超滤、密度梯度离心、凝胶层析等
溶解度 等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀等
电荷 电泳、离子交换层析等
吸附性质 吸附层析
对配体分子 亲和层析 的亲和力
凝胶层析的基本原理
凝胶层析（又叫分子筛层析或排阻层析） 指混合物随流动相经过装有凝胶作为固 定相的层析柱时，各组分因分子大小不 同而被分离的技术。
凝胶：一些具有立体网状结构 和一定孔径的高分子化合物。
分子大于凝胶孔隙范围的物质： 随着溶剂在凝胶颗粒间流动
分子小于凝胶孔隙范围的物质： 渗入凝胶颗粒的孔隙中
凝胶层析的过程
凝胶层析过程的数理关系
外水体积Vo
凝胶干体积Vg 柱床体积Vt = Vg + Vo + Vi
内水体积Vi
洗脱体积（Ve）：自加入样品时算起，到组分最大浓度 出现时所流出的洗脱液体积。
思考题
1. 为什么分离物分子量越大Kav值越 小？
2. 用凝胶柱层析分离不同蛋白质，怎 样才能得到较好的分离效果？
放映结束 感谢各位批评指导！
谢 谢！
让我们共同进步
Sephadex的常见规格（分级范围）
型号 （G-X）
G25 G-50 G-75 G100 G150~G200
分离范围 （分子量）
5000
1,500~30,000
3,000~70,000 4,000~150,000 5,000~800,000
适用范围
脱盐、小肽等 低分子量蛋白、多肽 中、低分子量蛋白、多肽 中、高分子量蛋白 高分子量蛋白