蛋白纯化层析柱
蛋白纯化层析柱填装
蛋白纯化层析柱填装
首先，选择合适的层析柱是非常重要的。
根据需要分离的蛋白
的大小、电荷、亲和性等特性，选择不同类型的填料，比如离子交
换柱、凝胶过滤柱或亲和层析柱等。
填料的粒径和柱子的尺寸也需
要根据样品的特性和分离要求来选择。
其次，准备填充柱子的缓冲液和样品。
缓冲液的选择取决于蛋
白的稳定性和溶解性，确保填充柱子前样品已经被适当地溶解和净化。
在填充柱子之前，需要先平衡填充柱子，通常使用与样品相同
的缓冲液。
填充柱子时，需要小心操作，确保填充均匀，避免气泡的产生。
填充柱子的速度应该适中，以免填料受到损坏或形成不均匀的层析床。
填充结束后，需要进行压缩，以确保填充物的密实度和柱子的
稳定性。
最后，进行层析实验前，需要对填充好的柱子进行质量控制，
比如检查柱子的均匀性和密实度，以及检测柱子的渗透性和分辨力。
只有填充好的柱子通过了质量控制，才能进行后续的层析实验。
总的来说，蛋白纯化层析柱填装是一个复杂而关键的步骤，需要仔细选择填料和柱子，合理准备样品和缓冲液，并严格控制填充和质量，以确保最终获得高质量的纯化蛋白。
实验三葡聚糖凝胶柱层析纯化蛋白质课件
实验三葡聚糖凝胶柱 层析纯化蛋白质课件
目录
• 实验原理 • 实验材料与设备 • 实验步骤 • 结果分析与讨论 • 注意事项与安全
01
实验原理
葡聚糖凝胶柱层析的原理
葡聚糖凝胶是一种具有三维网络结构的凝胶，具有良好的机 械强度和化学稳定性。它可以通过改变凝胶孔径的大小来分 离不同大小的分子。
当混合物溶液通过葡聚糖凝胶柱时，分子量较小的物质可以 进入凝胶孔内，而分子量较大的物质则被排阻在外。随着流 动相的流动，分子量小的物质逐渐被冲出凝胶柱，而分子量 大的物质则被滞留在凝胶柱内或缓慢流出。
结果的讨论与优化
结果讨论
根据实验结果，讨论凝胶柱层析纯化蛋白质的效果，分析可能影响分离效果和蛋 白质纯度的因素，如凝胶柱的填装、洗脱液的组成和洗脱速度等。
结果优化
根据结果讨论，提出优化实验条件的建议，如改变凝胶柱的填装方式、调整洗脱 液的组成或改变洗脱速度等，以提高蛋白质的分离效果和纯度。
05
注意事项与安全
分离度的计算
分离度是相邻两个峰之间的距离与峰宽的比值，可以通过测量洗脱液中 蛋白质的浓度变化来计算。
03
回收率的计算
回收率是纯化后蛋白质的质量与纯化前蛋白质的质量的比值，可以通过
称重法或紫外吸收法来测量。
蛋白质纯度的检测
检测方法：蛋白质纯度的检测方法包 括电泳法、质谱法、免疫学检测法和 光谱分析法等。电泳法是最常用的方 法之一，可以通过观察电泳图谱来判 断蛋白质的纯度。
电泳图谱的分析：电泳图谱中，单一 的、清晰的条带表明蛋白质纯度较高 ；而模糊的、多条带则表明蛋白质中 含有杂质。
纯度标准：蛋白质纯度标准通常由国 际蛋白质协会制定，分为一级、二级 和三级纯度标准。一级纯度标准要求 蛋白质中仅含有一种单体蛋白质，不 含有其他杂质；二级纯度标准要求蛋 白质中主要含有一种单体蛋白质，其 他杂质含量不得超过5%；三级纯度标 准要求蛋白质中主要含有一种单体蛋 白质，其他杂质含量不得超过10%。
亲和层析预装柱和填料选择指南
亲和层析预装柱和填料选择指南亲和层析是一种常用的生物分离技术，其基本原理是利用靶分子与具有特殊亲和性的固定相相互作用，实现目标分子的分离纯化。
该技术被广泛应用于蛋白质纯化、分析、制备以及药物研发中。
本文将为您介绍亲和层析预装柱和填料选择的指南。
首先，亲和层析的预装柱种类繁多，如Ni-NTA、GST、MBP、Protein A、Protein G、Protein L等。
选择合适的预装柱主要取决于目标蛋白的性质和亲和配体的选择。
以下是几种常见的亲和层析预装柱及其适用性。
1. Ni-NTA柱：适用于His标记蛋白的纯化。
该柱上的Ni2+离子与His标记相互作用，实现蛋白的选择性吸附。
Ni-NTA柱广泛应用于蛋白质纯化和表达系统中。
2. GST柱：适用于GST标记蛋白的纯化。
GST标记用于表达系统和蛋白质亲和纯化，其独特的亲和性可与谷胱甘肽S转移酶 (glutathione S-transferase，GST)结合。
3. MBP柱：适用于MBP标记蛋白的纯化。
麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein，MBP)可通过特异性辅助蛋白结合一些亲和配体，实现蛋白的纯化和表达。
4. Protein A/G/L柱：适用于免疫球蛋白 (IgG) 的富集。
Protein A/G/L分别与IgG的不同部位结合，用于IgG的富集和纯化，常用于抗体生产和医学诊断。
其次，填料选择也是亲和层析中一项重要的技术选择。
填料是用于填充柱体的固体介质，其性能直接影响到层析分离的效果。
以下是一些常见的填料种类及其特点：1.球形填料：球形填料具有均一的颗粒尺寸和良好的柱层分离性能。
常见的球形填料有琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。
2.凝胶填料：凝胶填料通常用于分离较大分子，如蛋白质、核酸等。
常见的凝胶填料有琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。
3.磁性填料：磁性填料具有较高的分离效率和灵敏度，常用于磁性亲和层析。
磁性填料结合预装柱可以实现高通量的自动化分离和纯化。
cytivagst亲和层析柱中文说明书
cytivagst亲和层析柱中文说明书CyTiva GST亲和层析柱是一种常用的色谱柱，用于蛋白质的纯化和分离。
亲和层析是一种基于蛋白质与特定配体之间的非共价相互作用而进行的纯化方法。
本文将详细介绍CyTiva GST亲和层析柱的原理、优点、使用方法和注意事项。
一、原理CyTiva GST亲和层析柱采用谷氨酸-S-转移酶(Glutathione-S-Transferase，GST)作为亲和配体。
GST是从谷胱甘肽(glutathione)中分离得到的一种蛋白质。
该配体与GST融合的蛋白质有很高的亲和力，可被其特异性地捕获。
在层析过程中，样品与柱填料表面的GST结合形成复合物。
通过洗脱缓冲液中pH、盐浓度或添加特定配体等的调节，使复合物分离并得到目标蛋白质。
二、优点1.高选择性：CyTiva GST亲和层析柱具有很高的选择性，可以高效地分离和纯化GST融合的目标蛋白质。
2.高纯度：层析过程中，非特异性结合蛋白质可被洗脱掉，从而得到高纯度的目标蛋白质。
三、使用方法1.准备工作：柱前洗脱，根据柱填料要求进行预处理。
2.样品处理：目标蛋白质表达并纯化后，与GST融合的载体进行融合。
此后，将样品溶液等体积注入已平衡的柱中。
3.洗脱条件的选择：根据样品的属性，选择适宜的洗脱缓冲液，进行洗脱。
可以按照pH、盐浓度、添加特定配体等来调节洗脱条件。
4.目标蛋白质洗脱：将目标蛋白质从柱中洗脱出来，收集洗脱液。
四、注意事项1.样品的处理：目标蛋白质应表达和纯化得到GST融合蛋白质。
2.柱前处理：根据柱填料的要求，进行柱前洗脱处理。
3.洗脱缓冲液的调节：根据样品的特性和所需的洗脱条件进行调节。
常用的洗脱条件包括调节pH、盐浓度、添加特定配体等。
4.洗脱收集：在洗脱过程中，及时收集洗脱液。
总结：CyTiva GST亲和层析柱是一种常用的蛋白质纯化和分离工具，基于GST与目标蛋白质的非共价相互作用。
它具有高选择性和高纯度的优点，可广泛应用于生物医药研究领域。
蛋白纯化柱子选择
蛋白纯化柱子选择
1. 目标蛋白的特性：首先要了解目标蛋白的分子量、等电点、疏水性等特性。
这些信息将有助于选择适合的柱子类型，例如分子筛、离子交换、亲和层析等。
2. 柱子的选择性：不同的柱子具有不同的选择性，可以根据目标蛋白与杂质之间的差异来选择柱子。
例如，离子交换柱可以根据蛋白质的电荷性质进行分离，而亲和层析柱则可以利用蛋白质与特定配体的亲和力进行纯化。
3. 柱子的容量：根据需要处理的样品量来选择柱子的容量。
柱子的容量应足够大，以满足实验需求，但也不宜过大，以免造成浪费。
4. 柱子的分辨率：分辨率是指柱子分离蛋白质混合物的能力。
对于复杂的混合物，可能需要使用具有高分辨率的柱子，如高效液相层析（HPLC）柱子。
5. 柱子的稳定性：柱子的稳定性对于长期的蛋白纯化非常重要。
选择具有良好稳定性和重复性的柱子可以确保实验结果的可靠性。
6. 柱子的价格和可获得性：不同柱子的价格差异较大，需要根据实验预算来选择合适的柱子。
同时，还要考虑柱子的可获得性，以确保实验的顺利进行。
7. 参考文献和经验：查阅相关的文献和其他研究者的经验可以提供有关不同柱子在类似实验条件下的性能信息，有助于做出更明智的选择。
综上所述，选择蛋白纯化柱子需要综合考虑目标蛋白的特性、柱子的选择性、容量、分辨率、稳定性、价格和可获得性等因素。
在选择之前，最好进行一些小规模的实验来评估不同柱子的性能，以确定最适合的柱子。
蛋白纯化层析系统操作规程
蛋白纯化层析系统操作规程一、实验前准备1.确认所需操作的蛋白样品、层析柱类型和材料的完整性和准备情况。
2.检查实验设备和仪器是否正常工作，如层析仪、洗脱缓冲液储备罐、洗脱梯度系统等。
3.预先准备所需的实验试剂和缓冲液，确保其浓度和pH值符合实验要求。
二、层析柱装填和平衡1.将所需的层析柱装填到层析系统中，确保柱床填充均匀且无明显空隙。
2.选择适当的洗脱缓冲液和梯度溶液，根据目标蛋白的特性调整pH值和盐浓度。
3.设置洗脱缓冲液的流量和梯度溶液的梯度程序。
三、样品准备和负载1.根据实验要求，选择适当的样品预处理方法，如离心、过滤、冻干等。
2.根据目标蛋白的亲和特性和pH效果，调整样品pH值并添加必要的盐。
3.将样品加入到层析柱中，确保样品均匀覆盖柱床，并避免气泡。
四、洗脱和收集1.开始运行层析仪，以洗脱缓冲液的流量洗脱样品。
2.监控样品的吸收曲线，调整洗脱缓冲液的pH值和盐浓度，以实现目标蛋白的洗脱。
3.相关实验过程中，及时收集和保存洗脱图峰的分馏物，便于后续分析。
五、柱的再平衡和清洗1.在洗脱完毕后，用适当的缓冲液进行柱的再平衡，以去除残留的洗脱缓冲液和杂质。
2.清洗柱子时，确保缓冲液的流量和浓度符合实验要求，并充分冲洗层析柱。
六、实验后清洗和消毒1.关闭层析仪和其他设备，清除样品和实验废液。
2.将使用过的层析柱经过清洗和消毒处理，准备下一次实验使用。
3.清洗操作台面和其他实验器材，确保实验环境清洁。
七、实验记录和数据分析1.记录重要的实验操作、观察和结果，包括样品负载量、洗脱曲线等。
2.对实验数据进行统计和分析，计算目标蛋白的纯化效率和纯度。
3.分析实验结果，并做出合理解释。
以上是蛋白纯化层析系统操作规程的一般步骤和要点，实验人员在进行实验前，应详细了解实验的要求和步骤，并根据实际情况进行相应的调整和优化。
此外，在实验过程中，要注意安全操作，遵守实验室规章制度，确保实验的顺利进行。
qsepharose柱层析法
qsepharose柱层析法qsepharose柱层析法是一种常用的蛋白质纯化技术，也是层析色谱法的一种应用。
本文将介绍qsepharose柱层析法的原理、操作步骤以及其在蛋白质纯化中的应用。
一、qsepharose柱层析法的原理qsepharose是一种阴离子交换层析介质，其基质为琼脂糖凝胶。
qsepharose柱层析法利用蛋白质表面带负电的残基与qsepharose 柱层析介质上的正电荷基团之间的静电作用相互吸附和解吸，实现蛋白质的纯化。
二、qsepharose柱层析法的操作步骤1. 柱层析前的准备工作(1) 根据实验需求选择合适的qsepharose柱层析介质和缓冲液。
(2) 将qsepharose柱层析介质放入柱子中，用缓冲液洗涤柱子，直至出现均匀的流体。
(3) 用缓冲液平衡柱子，通常是将柱子与缓冲液连接起来，让缓冲液从柱子中流出，直至流出的缓冲液与柱子中的缓冲液浓度相同。
2. 样品加载与洗脱(1) 将待纯化的蛋白质样品加入到平衡好的qsepharose柱中。
(2) 用缓冲液洗脱非特异结合的杂质，直至洗脱液中的蛋白质浓度降至背景水平。
(3) 用梯度洗脱法逐渐增加盐浓度，使目标蛋白质从柱子中洗脱。
三、qsepharose柱层析法在蛋白质纯化中的应用qsepharose柱层析法广泛应用于蛋白质的纯化和富集。
其优点包括操作简便、纯化效果好、适用范围广。
以下是qsepharose柱层析法在蛋白质纯化中的几个常见应用：1. 蛋白质富集qsepharose柱层析法可以根据蛋白质的表面电荷特性进行选择性富集。
例如，可以利用qsepharose柱层析法从复杂的样品中富集特定电荷的蛋白质。
2. 蛋白质纯化qsepharose柱层析法可以将目标蛋白质从其他杂质中纯化出来。
通过调节缓冲液的pH和离子强度，可以实现对不同电荷的蛋白质的分离。
3. 蛋白质结构研究qsepharose柱层析法可以用于蛋白质的结构研究。
1ml 层析柱空柱
1ml 层析柱空柱层析柱是一种广泛应用于分离和纯化化合物的实验室技术。
1ml层析柱是其中一种类型的层析柱，其具有1ml的样品处理容量。
层析柱中的空柱则是指没有填充分离介质的柱子。
本文将介绍1ml层析柱空柱的特点、应用领域以及使用注意事项。
1. 1ml层析柱空柱的特点1ml层析柱空柱的最显著特点是其样品处理容量为1ml。
这使得它在需要处理小样品量的实验中非常有用。
空柱意味着柱子内没有填充任何分离介质，因此，它的分离能力和分辨率较低。
然而，空柱具有一定的吸附能力，可以用于去除某些杂质或无机盐，以达到简单的样品净化目的。
2. 1ml层析柱空柱的应用领域1ml层析柱空柱的应用领域非常广泛。
以下是一些常见的应用领域：2.1 蛋白质纯化1ml层析柱空柱可以用于简单的蛋白质纯化过程中的预处理步骤。
例如，可以通过空柱去除样品中的无机盐、杂质或其他干扰物质，以提高后续纯化步骤的效果。
2.2 药物分析1ml层析柱空柱可以用于药物分析中的样品预处理步骤。
通过空柱，可以去除样品中的杂质，净化样品，以提高后续分析的准确性和灵敏度。
2.3 生物大分子分析1ml层析柱空柱也可用于生物大分子（如DNA、RNA和蛋白质）的分析。
空柱可以去除样品中的无机盐、杂质或其他干扰物质，提高分析的精确性和可靠性。
2.4 质量控制1ml层析柱空柱可以用于质量控制过程中的样品净化步骤。
通过空柱，可以去除样品中的杂质，提高质量控制的准确性和可靠性。
3. 1ml层析柱空柱的使用注意事项使用1ml层析柱空柱时，有一些注意事项需要遵守：3.1 预处理在使用空柱之前，柱子需要进行预处理，以去除可能存在的残留杂质。
常见的预处理方法包括用洗涤液洗涤柱子，或者用溶剂进行反洗。
3.2 样品处理量由于1ml层析柱空柱的样品处理容量为1ml，因此，需要确保样品的体积不超过1ml。
如果样品体积较大，可以考虑使用更大处理容量的层析柱。
3.3 分离介质空柱内没有填充分离介质，因此，它的分离能力和分辨率较低。
蛋白纯化层析柱--GE 详细介绍
蛋白纯化层析柱--GE 详细介绍蛋白纯化层析柱2021-06-15 15:19:14 易生物仪器浏览次数：1164 网友评论 0 条从个人学术性实验室到大型的医药制造企业，小型或者大规模的蛋白纯化通常都需要几种类型的液相色谱仪。
这些相关的大部分技术已应用了多年，但是新型柱料的发展为这些利用蛋白物理和化学特性进行分离的，经过时间考验的方法注入了新的力量。
其中最值得提到的就是...关键词：蛋白离子交换分离分子物质树脂从个人学术性实验室到大型的医药制造企业，小型或者大规模的蛋白纯化通常都需要几种类型的液相色谱仪。
这些相关的大部分技术已应用了多年，但是新型柱料的发展为这些利用蛋白物理和化学特性进行分离的，经过时间考验的方法注入了新的力量。
其中最值得提到的就是凝胶过滤层析技术（gel filtration，GF），离子交换层析技术（ion exchange，IEX），羟基磷灰石层析（hydroxyapatite，HAP）和疏水作用层析（hydrophobic interaction，HI)，以及亲和层析和高效液相色谱方法（high-performance liquid chromatography，HPLC）。
对于一个初接触蛋白纯化的新手而言，从哪儿下手也许是令人头疼的一件事，但是幸运的是目前这些流程都已经逐步系统化了。
GE Healthcare（原Amersham Biosciences）的技术顾问Andrew Mitchell解释道，通常利用液相色谱技术进行蛋白纯化有三步：捕获――从细胞其它成份，比如DNA和RNA中分离需要的蛋白；区分――从与目的蛋白具有相近的大小，或者相似的物理/化学特征的污染物中分离蛋白；修饰――使分离得到的样品处于可使用状态。
这每一个纯化的步骤都有特定的色谱层析技术和最佳的beads大小。
第一步捕获步骤，也就是从细胞裂解物粗成份中分离蛋白，这需要一个具有高容量和高流量（flow rate）的填料。
血清蛋白柱层析法洗脱峰曲线
血清蛋白柱层析法洗脱峰曲线
血清蛋白柱层析法是一种常用的分离和纯化血清蛋白的方法。
洗脱峰曲线描述了在柱层析过程中，不同成分在不同时间点从柱上洗脱出来的曲线。
血清蛋白柱层析法通常包括以下步骤：样品加载、洗脱、等温浓缩和洗脱物分析。
在样品加载步骤中，血清样品经过预处理后被加载到层析柱上。
然后通过洗脱步骤，使用不同的洗脱缓冲液，逐渐改变柱中的溶质浓度，从而将不同成分分离出来。
洗脱峰曲线就是描述不同成分在洗脱过程中的相对峰高和峰面积随时间的变化情况。
洗脱峰曲线可以提供以下信息：
1. 成分分离情况：通过观察不同的峰出现时间和高度，可以确定样品中的不同成分是否被成功分离。
2. 成分纯度：洗脱峰的峰形和峰宽可以反映样品中所含成分的纯度，峰形对称和峰宽窄表示样品的纯度较高。
3. 柱效和柱使用寿命：洗脱峰曲线的对称性和峰宽的变化反映了柱性能和使用寿命，当峰形变得不对称且峰宽变宽时，可能意味着柱效已经下降，需要更换柱子。
血清蛋白柱层析法洗脱峰曲线的分析可以帮助确定最佳的洗脱条件和柱子使用寿命，提高血清蛋白的分离纯化效果。
蛋白层析空柱
蛋白层析空柱
关于蛋白层析空柱介绍如下：
蛋白层析空柱是一种用于蛋白质分离纯化的层析柱，具有特定的填料和结构，可以用于蛋白质的分离、纯化和分析。
以下是关于蛋白层析空柱的详细介绍：
1. 结构：蛋白层析空柱主要由柱体、填料和柱头等部分组成。
柱体通常是不锈钢管或玻璃管，填料可以是硅胶、琼脂糖、聚丙烯酰胺等，根据不同的分离需求选择不同的填料。
柱头是进样口，可以将样品注入层析柱。
2. 工作原理：层析是一种利用不同物质在固定相和流动相之间分配系数不同的原理，使不同物质在层析柱中得到分离的方法。
在蛋白层析中，蛋白质分子与填料之间的相互作用力使其在流动相和固定相之间进行分配，根据不同的分配系数，蛋白质分子在层析柱中得到分离。
3. 操作步骤：蛋白层析空柱的操作步骤包括平衡、上样、洗脱、检测等。
平衡是使层析柱中的填料充分湿润，以便进行后续的上样和洗脱步骤。
上样是将待分离的蛋白质样品加入层析柱中。
洗脱是通过改变流动相的成分，使不同蛋白质分子根据其特性在层析柱中移动并得到分离。
检测是对洗脱出来的组分进行检测和收集。
4. 应用：蛋白层析空柱在蛋白质研究和生物工程领域有广泛的应用，例如蛋白质纯化、蛋白质分析和鉴定、蛋白质相互作用研究等。
通过使用蛋白层析空柱，可以实现对蛋白质的分离、纯化和分析，为
生物学和医学研究提供有力的工具。
总之，蛋白层析空柱是一种重要的蛋白质分离纯化工具，可以根据不同的需求选择不同的填料和操作方法，为蛋白质研究和生物工程领域的发展提供支持。
q柱纯化蛋白原理
q柱纯化蛋白原理Q柱属于离子交换柱层析技术的一种，常用于蛋白质纯化中。
本文将详细介绍Q柱纯化蛋白的原理及操作步骤。
一、原理Q柱的交换基质是一种具有阳离子交换能力的离子交换树脂。
蛋白质在缓冲液中带有正电荷或负电荷，与Q柱的阴离子或阳离子交换基团发生静电吸附，从而被分离出来。
通常在pH 7.5-8.5的缓冲液中进行Q柱层析，pH值的选择需要考虑到目标蛋白的等电点（pI），使其保持带电状态。
如果蛋白质的pI小于pH 8.5，则会以负电的形式存在，可以使用弱阳离子交换柱；如果蛋白质的pI大于pH 7.5，则会以正电的形式存在，可以使用弱阴离子交换柱。
如果目标蛋白的pI与pH 7.5-8.5之间，则可以使用强阳离子交换柱或强阴离子交换柱。
二、操作步骤1、样品的制备准备待纯化的蛋白质样品，除掉悬浮物和泡沫，并且将样品预冷至4℃。
2、Q柱的操作在打开柱子前，应先在柱子底部放置一些石英砂或氧化铝，以防止样品浆湖压缩柱层。
将Q柱装入柱架中，并且在顶部加入过滤器床。
用缓冲液进行柱子均相化，并清洗柱子。
用样品缓冲液进行柱子均相化，以引起静电吸附，加强分离效果。
3、样品装载将待纯化的样品通过0.45微米滤膜过滤并将样品缓冲液加入适量的离心管中。
将离心管中的样品缓冲液均匀地加入Q柱柱床中，稳定将样品加入柱子中。
4、洗脱柱样品被平衡后，用缓冲液进行柱子冲洗，使不结合于柱子的蛋白质被彻底清除。
清洗完成之后，将柱子中的目标蛋白缓慢洗脱，收集洗脱液进行后续的纯化或分析。
三、注意事项1、准备充分的缓冲液和清洗液，以保证连续的流动和优质分离。
2、使用过滤器床过滤样品和洗脱液，以防止样品中的悬浮物阻塞柱床。
3、控制洗脱流量，避免过快或过慢，流速一般为柱床高度的1-2倍。
4、根据样品的性质和Q柱的性质选择不同的缓冲液和pH值。
5、必要时使用其他层析技术进行单步纯化。
四、结论在蛋白纯化中，Q柱是值得信赖的一种层析技术，适用于小至几kDa的小分子到几百kDa的大分子蛋白质的分离。
蛋白质柱层析分离纯化验证现状1
Industry Perspective on the Validation of Column-Based Separation Processes for the Purification of Proteins蛋白质柱层析别离纯化验证现状I.Foreword前言The purpose of this document is to outline some of the significant issues related to the validation of columnbased separation processes used in the purification of proteins produced by recombinant DNA (rDNA), hybridoma technology, or peptide synthesis. While validation of these processes has been identified as a first priority by the PDA Biotechnology Task Force, the issues raised in certain sections of this document may have broader applications, including processes for non-protein pharmaceutical products purified by HPLC, as well as protein pharmaceuticals which are not produced by rDNA, hybridoma, or peptide synthesis technologies.这个文件的目的是概述一些关于重组DNA〔rDNA〕，杂交瘤技术，或多肽合成过程中有重大意义的柱别离纯化验证。
蛋白纯化-Ni亲和层析柱法
.Ni亲和层析柱法纯化带组氨酸标签的重组蛋白纯化设备：纯化仪：?KTA purifier(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)TM HP-5 mL (GE Healthcare, , Uppsala, Sweden)HisTrapNi亲和层析柱：试剂：所有上柱的试剂均需经0.2 μM孔径过滤器过滤并超声波震荡除气处理方可使用。
Binding Buffer：20 mM NaHPO-NaHPO, pH 7.4, 500 mM NaCl, 5 mM 咪唑4224Elution Buffer：20 mM NaHPO-NaHPO, pH 7.4, 500 mM NaCl, 500 mM 咪唑4242Stripping Buffer: 20 mMNaHPO-NaHPO, pH 7.4, 500 mM NaCl, 50 mM EDTA 442220%乙醇：200 mL无水乙醇，加蒸馏水定容至1L0.1M NiSO: 称取2.6284g NiSO·6HO，加蒸馏水溶解，定容至100 mL244操作步骤：1 样品前处理取诱导后菌液50 mL，4℃、5000 rpmin离心10 min收集菌体，以25 mL Binding Buffer重悬菌体，冰浴下超声波破碎至澄清，4℃、12000 rpmin离心25 min，取上清，经0.2 μM孔径过滤器过滤后待用。
2 Ni柱前处理上样前，使用10倍柱体积的Binding Buffer以5 mL/min的流速平衡镍柱。
3 上样经离心、过滤处理后的样品以1 mL/min的流速通过衡流泵加载到平衡后的Ni柱上，收集穿透液，可反复上样以提高样品的挂柱效率。
4 平衡上样后的Ni柱将已结合目的蛋白的Ni柱回接到?KTA purifier上，用10倍柱体积的Binding Buffer以5mL/min的流速再次平衡镍柱以去除未结合上的蛋白。
5 梯度洗脱以梯度的Elution Buffer/Binding Buffer混合液洗脱Ni柱(梯度的界定因蛋白而不同，可经预实验确定)，流速为5 mL/min，并监测OD值，收集蛋白吸收峰对应的洗脱液，经280SDS-PAGE检测后确定目的蛋白所在。
蛋白纯化层析柱--GE 详细介绍
蛋白纯化层析柱2011-06-15 15:19:14 易生物仪器浏览次数：1164 网友评论0 条从个人学术性实验室到大型的医药制造企业，小型或者大规模的蛋白纯化通常都需要几种类型的液相色谱仪。
这些相关的大部分技术已应用了多年，但是新型柱料的发展为这些利用蛋白物理和化学特性进行分离的，经过时间考验的方法注入了新的力量。
其中最值得提到的就是...关键词：蛋白离子交换分离分子物质树脂从个人学术性实验室到大型的医药制造企业，小型或者大规模的蛋白纯化通常都需要几种类型的液相色谱仪。
这些相关的大部分技术已应用了多年，但是新型柱料的发展为这些利用蛋白物理和化学特性进行分离的，经过时间考验的方法注入了新的力量。
其中最值得提到的就是凝胶过滤层析技术（gel filtration，GF），离子交换层析技术（ion exchange，IEX），羟基磷灰石层析（hydroxyapatite，HAP）和疏水作用层析（hydrophobic interaction，HI)，以及亲和层析和高效液相色谱方法（high-performance liquid chromatography，HPLC）。
对于一个初接触蛋白纯化的新手而言，从哪儿下手也许是令人头疼的一件事，但是幸运的是目前这些流程都已经逐步系统化了。
GE Healthcare（原Amersham Biosciences）的技术顾问Andrew Mitchell解释道，通常利用液相色谱技术进行蛋白纯化有三步：捕获——从细胞其它成份，比如DNA和RNA中分离需要的蛋白；区分——从与目的蛋白具有相近的大小，或者相似的物理/化学特征的污染物中分离蛋白；修饰——使分离得到的样品处于可使用状态。
这每一个纯化的步骤都有特定的色谱层析技术和最佳的beads大小。
第一步捕获步骤，也就是从细胞裂解物粗成份中分离蛋白，这需要一个具有高容量和高流量（flow rate）的填料。
bead大小比较大，范围比较宽（比较于bead大小平均值）的“fast flow”填料比较理想，这种填料也有利于防止目标蛋白被水解——因为速度比较快。
分离纯化蛋白质的方法及原理
分离纯化蛋白质的方法及原理分离纯化蛋白质是生物化学和分子生物学研究中的重要步骤。
蛋白质的分离与纯化可以使我们更好地理解蛋白质的结构和功能，并为进一步的研究提供可靠的蛋白质样本。
下面将介绍一些常见的蛋白质分离和纯化方法及其原理。
1.存活细胞提取法：这种方法是从细胞中提取蛋白质。
先将细胞破碎，然后通过离心等手段去除细胞碎片和细胞器，留下蛋白质溶液。
使用该方法分离的蛋白质包括细胞质蛋白、细胞膜蛋白等。
2.柱层析法：柱层析法是一种广泛应用的蛋白质分离方法。
它主要依据蛋白质的性质（如分子质量、电荷、亲水性等）在各种填料（如离子交换、凝胶透析、亲和层析等）上的差异进行选择性分离。
原理是根据蛋白质与填料之间的相互作用，通过溶液通过填料层析柱时，不同蛋白质以不同速率在填料间扩散，并在填料内发生各种相互作用，从而实现蛋白质的分离。
该方法可同时分离多个蛋白质，并制备高纯度的蛋白质。
3.电泳法：电泳法是根据蛋白质在电场中的迁移速率、电荷性质和分子大小等特征进行分离的方法。
常见的电泳方法包括SDS-、等电聚焦电泳、二维电泳等。
其中，SDS-是最常用的蛋白质分离方法之一，它通过SDS（十二烷基硫酸钠）使蛋白质变成带负电荷的复合物，继而在电场作用下，按照蛋白质的分子质量大小进行分离。
4.超滤法：超滤法是根据不同分子量的蛋白质在超滤膜上的渗透性差异进行分离。
超滤分离可以根据孔隙的大小将不同分子量的蛋白质阻滞，有效地去除较小分子量的杂质，得到目标蛋白质的高纯度。
5.亲和层析法：亲和层析法是通过目标蛋白质与配体之间的特异性结合进行分离的方法。
配体可以是特定的抗体、金属离子、凝胶颗粒等。
原理是通过将配体共价结合到固定相上，然后将蛋白质样品溶液通过，使目标蛋白质与配体发生特异性结合，其他非特异性结合的蛋白质被洗脱，最后目标蛋白质被洗出。
6.上下层析法：上下层析法是一种根据沉降速度差异进行分离的方法。
利用离心过程中不同蛋白质溶液中蛋白质的不同沉降速度将蛋白质分离。
蛋白质纯化柱-ni
网址：
合蛋白； 4) 用缓冲液B和缓冲液C配制的不同浓度缓冲液D
洗脱； 9 最高纯度洗脱方案：用含0、60、100、150、
200、250mM 咪唑的缓冲液D分步洗脱，每 个梯度2~3倍介质体积洗脱； 9 最高收率洗脱方案：先用5~10倍介质体积 含20mM咪唑的缓冲液D洗脱，再用5~10倍 介质体积含250mM咪唑的缓冲液D洗脱。 注：纯化过程流速不宜过快，对于1ml介质，流速 保持在0.5ml/min为宜。 5. 介质清洗与再生： 如果使用一段时间以后，介质上有杂质沉积导 致介质颜色改变和蛋白结合能力下降，需对介质进 行清洗或再生。 z 介质清洗： 1) 用10倍介质体积0.5M NaOH过柱，适当调整流 速，或洗脱至10倍介质体积时停30min后继续洗 脱，保证介质与NaOH溶液接触时间达到30min 以上。 2) 用10倍介质体积去离子水洗去层析柱中的碱 液。 3) 用10倍介质体积缓冲液A平衡层析柱。 z 介质再生： 1) 用2~5倍介质体积脱镍缓冲液（50mM Na3PO4， 300mM NaCl，100mM EDTA，pH 8.0）过柱； 2) 用5-10倍介质体积0.5M NaOH过柱，适当调整 流速，如流速较快，则洗脱至10倍介质体积时 停30min后继续洗脱，保证介质与NaOH溶液接 触时间达到30min以上； 3) 用10倍介质体积去离子水洗柱； 4) 用3倍介质体积10mM Na3PO4，1M NaCl，pH 7.4 缓冲液平衡层析柱； 5) 用3倍介质体积20mM NiCl2或NiSO4 (溶于去离 子水)过柱； 6) 用3倍介质体积10mM Na3PO4，1M NaCl，pH 7.4 缓冲液洗柱； 7) 用5倍介质体积缓冲液A平衡层析柱。
网址：
分离His融合蛋白及能被金属离子吸附的多肽、 蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白。
中压层析柱蛋白纯化
中压层析柱蛋白纯化
首先，中压层析柱蛋白纯化的原理是基于蛋白质在不同固定相
上的亲和性差异。
在这种方法中，混合物溶液首先被加载到层析柱上，然后通过向柱中通入缓冲液或溶剂来推动混合物在柱中的运动。
不同的蛋白质成分会根据其在固定相上的亲和性差异而被分离开来，从而实现纯化。
其次，中压层析柱蛋白纯化的步骤通常包括预处理、样品加载、洗脱和再生。
在预处理阶段，通常需要对混合物进行处理，如离心、过滤等，以准备样品。
然后将样品加载到层析柱上，通过洗脱缓冲
液来洗脱非目标成分，最后再通过适当的条件将目标蛋白洗脱下来。
在完成纯化后，通常还需要对层析柱进行再生以准备下一次使用。
此外，中压层析柱蛋白纯化的选择固定相和缓冲液的pH、离子
强度等条件对纯化效果有重要影响。
固定相的选择通常取决于目标
蛋白的性质和亲和性，而缓冲液的选择则需要考虑到目标蛋白的稳
定性和溶解性。
此外，纯化过程中需要严格控制温度、流速等条件，以确保纯化效果和蛋白质的活性。
总的来说，中压层析柱蛋白纯化是一种常见且有效的蛋白质纯
化方法，通过利用蛋白质在不同固定相上的亲和性差异来实现分离和纯化。
在实际操作中，需要根据目标蛋白的性质和纯化要求来选择合适的固定相、缓冲液和操作条件，以达到最佳的纯化效果。
蛋白亲和层析柱
蛋白亲和层析柱
蛋白亲和层析柱是一种用于分离和纯化蛋白质的工具，它基于亲和层析技术，利用生物分子间的专一亲和力进行分离。
亲和层析是一种层析技术，它利用生物分子间存在很多特异性的相互作用（如抗原和抗体、酶和底物或抑制剂、激素和受体等），通过将具有亲和力的两个分子中的一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。
以蛋白A亲和层析柱为例，它的层析介质为蛋白A，可与抗体的Fc片段结合，因此常用于抗体的纯化。
在使用蛋白A亲和层析柱时，需要先用平衡缓冲液平衡柱子，使其达到适当的离子强度和pH值，然后将待纯化的抗体溶液加载到柱子上，让抗体与蛋白A结合。
接着，用洗脱缓冲液洗脱结合在柱子上的抗体，收集洗脱下来的抗体溶液，进行后续的处理和分析。
需要注意的是，不同的蛋白亲和层析柱可能需要不同的操作步骤和条件，因此在使用前需要仔细阅读说明书，并根据实际情况进行操作。
蛋白纯化空柱
蛋白纯化空柱
蛋白纯化空柱介绍如下：
蛋白纯化预装柱是专为抗体、重组蛋白和其他生物大分子纯化、脱盐、浓缩而设计的。
蛋白层析柱管也不同一般的玻璃柱，柱床长度通常可调节，分为一端可调轴向压缩和两端可调轴向压缩柱。
现推出ZXK夹套式蛋白层析柱和LK系列蛋白层析柱，广泛应用于蛋白、多肽、抗体、酶、病毒、重组蛋白等生物分子纯化。
蛋白纯化预装柱是专为抗体、重组蛋白和其他生物大分子纯化、脱盐、浓缩而设计的。
该类型的中压层析空柱，适合科研院所和工业客户进行小批量分离和纯化抗体、蛋白等生物大分子，并能方便有效地进行工艺放大。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
蛋白纯化层析柱2011-06-15 15:19:14 易生物仪器浏览次数:1164 网友评论 0 条从个人学术性实验室到大型的医药制造企业，小型或者大规模的蛋白纯化通常都需要几种类型的液相色谱仪。
这些相关的大部分技术已应用了多年，但是新型柱料的发展为这些利用蛋白物理和化学特性进行分离的，经过时间考验的方法注入了新的力量。
其中最值得提到的就是... 关键词:蛋白离子交换分离分子物质树脂从个人学术性实验室到大型的医药制造企业，小型或者大规模的蛋白纯化通常都需要几种类型的液相色谱仪。
这些相关的大部分技术已应用了多年，但是新型柱料的发展为这些利用蛋白物理和化学特性进行分离的，经过时间考验的方法注入了新的力量。
其中最值得提到的就是凝胶过滤层析技术(gel filtration，GF)，离子交换层析技术(ion exchange，IEX)，羟基磷灰石层析(hydroxyapatite，HAP)和疏水作用层析(hydrophobic interaction，HI)，以及亲和层析和高效液相色谱方法(high-performance liquid chromatography，HPLC)。
对于一个初接触蛋白纯化的新手而言，从哪儿下手也许是令人头疼的一件事，但是幸运的是目前这些流程都已经逐步系统化了。
GE Healthcare(原Amersham Biosciences)的技术顾问Andrew Mitchell解释道，通常利用液相色谱技术进行蛋白纯化有三步:捕获——从细胞其它成份，比如DNA和RNA中分离需要的蛋白;区分——从与目的蛋白具有相近的大小，或者相似的物理/化学特征的污染物中分离蛋白;修饰——使分离得到的样品处于可使用状态。
这每一个纯化的步骤都有特定的色谱层析技术和最佳的beads大小。
第一步捕获步骤，也就是从细胞裂解物粗成份中分离蛋白，这需要一个具有高容量和高流量(flow rate)的填料。
bead大小比较大，范围比较宽(比较于bead大小平均值)的“fast flow”填料比较理想，这种填料也有利于防止目标蛋白被水解——因为速度比较快。
第二步则对分辨率要求更高，需要更好的从混合物中分离需要的成份。
通常bead的大小与分辨率成反比，因此在这一部中比较小的bead比较合适。
吸附性的技术，比如离子交换IEX和疏水作用HI通常被用在纯化的这前两个步骤，而凝胶过滤则会留到了最后的修饰那一步，用于小体积，高浓度的样品。
另外要注意，进行凝胶过滤层析时，样品的体积应该保持在柱床体积的1%到4%。
选择柱料的时候有两个因素要考虑到，针对目的蛋白的选择性和有效性——这些可以由洗脱峰的宽度来说明。
其中选择性主要是指填料与目的蛋白相互作用以及结合的能力，IEX和HI层析方法就是指目标分子与筛分介质之间的相互作用，而GF的选择性依赖于填料的分馏范围(fractionation range)。
柱料的有效性则是指层析介质洗脱样品得到显著层析峰的能力，Mitchell表示，“如果你的峰值不集中，比较宽，那么即使是选择性很好，分辨率仍然会被消弱”。
bead越大，洗脱峰就越不集中，柱子的有效性就越低。
纯化洗脱相近的蛋白需要高效性，高选择性和高效性的结合就会得到高分辨率。
凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)凝胶过滤法(gel filtration)也称为排阻层析(exclusion chromatography)、凝胶层析(gel chromatography)或分子筛层析(molecular sieve chromatofraphy)，它是在1960年后发展出来的技术。
凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，内部具有网状筛孔，利用球状凝胶内的筛孔，使分子流过填充凝胶的管柱时，大分子无法进入凝胶筛孔，而只流经凝胶及管柱间的孔隙，很快就可以流出管柱，较小的分子因为进入凝胶内的筛孔，故在管柱内的停留时间较长，由此区分大小不同的分子，亦可与已知大小的分子作比较而定出一分子的分子量。
一般状况下，凝胶不会吸附成份，所有欲分离物质都会被洗出，这是凝胶层析法与其它层析法不同的地方。
目前常用的凝胶包括3个主要类型:1. PolydextranPolydextran的商品名称是Sephadex，它几乎不溶于溶剂中，亲水性强，能迅速在水和电解质溶液中膨胀，在碱性的环境中十分稳定，所以可以用碱去除凝胶上的污染物。
Sephadex依其吸水量有不同型号，如 G-25、G-75、G-100或是G-200，G 后面的数字为凝胶吸水量再乘以10，以G-25为例，表示1克干燥的G-25凝胶可以吸水2.5 ml。
GE的Sephadex G-25柱就是这一系的产品，十分适合于快速处理不同体积的样品，可以用在层析纯化的前、中、后的任一阶段，即适用于实验室操作，也可以在生产上应用。
达柱体积30,的样品可通过简单的一次性上柱，脱盐并转换道新的缓冲液中，一些不需要的低分子量的物质，如盐分子就被洗脱了，这种产品最大的特点就是高速和高容量，处理起样品来快速高效。
2. PolyacrylamidePolyacrylamide是一种合成凝胶，商品名Bio-Gel P，干粉颗粒状，在溶剂中自动溶成胶体，依胶的分离范围不同，分成Bio-Gel P-2至Bio-Gel P-300，P后面的数字乘以1000为最大过滤限度。
Polyacrylamide的化学性质不活泼，但它在极端的pH 下会被水解，水解后产生的COOH-具有离子交换的性质，因此pH 值应尽量控制在2-10之间。
3. Agarose商品名Separose，属于天然凝胶，依凝胶中干胶的百分含量，分为Sepharose 2B，4B和6B。
Agarose gel 是一种大孔凝胶，主要用于像核酸或病毒这些分子量400,000以上的物质，因其颗粒软，在分离过程有时会阻塞管柱，造成流速减慢，又因其在摄氏50度以上会融化，故需于较低温的环境中进行层析。
Agarose 做成beads后不能再脱水干燥，所以要在湿态中保存。
凝胶和管柱的选择:凝胶的材质需为化学惰性，与分离物不能产生变性(denature)或是其它化学反应，最好具有能长期反复使用的稳定性，并可以在较大的pH和温度范围内使用。
由于凝胶上的离子交换基团会吸附带电荷的物质，产生离子交换的效果，所以凝胶上最好不具有离子交换的基团。
此外，凝胶要有一定的机械强度，在层析过程中才不会变形，增加机械强度也可使层析在较高压力的环境进行，缩短分离时间。
凝胶颗粒的粗细与分离效果有直接关系，颗粒细的分离效果好，但流速慢而费时，因此要依据实际的需要来选择。
对于分子量较小的物质，一般采用polydextran或polyacrylamide材质的凝胶，大分子物质则使用agarose。
以Sephadex为例，Sephadex G-50可用于区分分子量1,500~30,000之分子，而Sephadex G-75 凝胶可区分分子量3,000~70,000之分子，所以若要分离分子量10,000及20,000之分子，两种都适用。
1的管柱，且管柱如果要分离的分子大小相差很多，则可选用柱高:直径,5:1~15:体积要大于4~15倍的样品体积;如果要分离的物质之间分子量差异不大，则要选用柱高:直径,20:1~100:1的管柱，且管柱体积要大于25~100倍的样品体积。
凝胶的处理:商品凝胶一般是干燥的颗粒，使用前要先泡在欲使用的冲洗液中，使它充份膨胀，否则有引起凝胶柱破裂的危险。
热胀法是常用的前处理法，即把浸于冲洗液中的凝胶加热，让它膨胀并除去气泡，温度够高的话(加温至近沸腾)也可消毒杀菌。
凝胶处理过程不能剧烈搅拌，如此易使颗粒破裂，影响流速。
将凝胶装入管柱的方法有很多种，实验室常用的方法是先在柱中加入约1/3 体积的冲洗液，边轻轻搅伴边将凝胶悬浮液倒入其中，等到底部沉积约1~2公分的凝胶后，打开下方出口让水流出，上面不断加入悬浮液，等到沉积到离顶部约3~5公分处停止，让3~5倍柱床体积的缓冲液流过层析柱。
若用polydextran的凝胶，可放入有颜色的蛋白质(如cytochrome c)流过管柱，看看色带是否均匀下降，不均匀或出现气泡，凝胶均需倒出重新填装。
冲洗缓冲液仅需留高于柱床2 公分左右，多余的可用滴管吸去，再将出口打开使冲洗液流到距表面1~2公厘，关闭出口，用滴管缓缓加入样品再打开出口，样品完全渗入凝胶内后，加入约4公分冲洗液，出口处接上收集瓶开始层析。
由于polydextran 和agarose都属于多醣类，一旦微生物生长过多，分泌的酶会水解凝胶使其性质改变，为了防止这种情况发生，凝胶最好采用真空或低温保存，但温度不能过低使凝胶冻结。
加入抑菌剂(chlohexidine, chlorbutol, phenylmercuric salts, NaOH等)也是常用的方法。
长时间不用的凝胶可用干燥保存法，也就是把使用过的凝胶用水除去碎颗粒和杂质，再用不同浓度的酒精，由70%、90%到95%逐步脱水，在摄氏60~80度下烘干，不能加热的Sepharose则用乙醚洗涤干燥。
离子交换层析(ion exchange，IEX)离子交换层析是在以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。
离子交换剂是由基质、电荷基团和反离子构成的。
离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。
离子交换层析法大致分为5个步骤:1. 离子扩散到树脂表面。
2. 离子通过树脂扩散到交换位置。
3. 在交换位置进行离子交换;被交换的分子所带电荷愈多，它与树脂的结合愈紧密，也就愈不容易被其它离子取代。
4. 被交换的离子扩散到树脂表面。
5. 冲洗液通过，被交换的离子扩散到外部溶液中。
离子交换树脂的交换反应是可逆的，遵循化学平衡的规律，定量的混合物通过管柱时，离子不断被交换，浓度逐渐降低，几乎全部都能被吸附在树脂上;在冲洗的过程中，由于连续添加新的交换溶液，所以会朝正反应方向移动，因而可以把树脂上的离子冲洗下来。
如果被纯化的物质是氨基酸类的分子，则分子上的净电荷取决于氨基酸的等电点和溶液的pH值，所以当溶液的pH 值较低，氨基酸分子带正电荷，它将结合到强酸性的阳离子交换树脂上;随着通过的缓冲液pH逐渐增加，氨基酸将逐渐失去正电荷，结合力减弱，最后被洗下来。
由于不同的氨基酸等电点不同，这些氨基酸将依次被洗出，最先被洗出的是酸性氨基酸，如apartic acid和glutamic acid(在约pH3~4时)，随后是中性氨基酸，如glycine和alanine。
碱性氨基酸如arginine和lysine在pH值很高的缓冲液中仍带有正电荷，因此这些在约pH值高达10~11时才出现。