蛋白纯化层析柱

蛋白纯化层析柱

2011-06-15 15:19:14 易生物仪器浏览次数:1164 网友评论 0 条

从个人学术性实验室到大型的医药制造企业，小型或者大规模的蛋白纯化通常都需要几种类型的液相色谱仪。这些相关的大部分技术已应用了多年，但是新型柱料的发展为这些利用蛋白物理和化学特性进行分离的，经过时间考验的方法注入了新的力量。其中最值得提到的就是... 关键词:蛋白离子交换分离分子物质树脂从个人学术性实验室到大型的医药制造企业，小型或者大规模的蛋白纯化通常都需要几种类型的液相色谱仪。这些相关的大部分技术已应用了多年，但是新型柱料的发展为这些利用蛋白物理和化学特性进行分离的，经过时间考验的方法注入了新的力量。其中最值得提到的就是凝胶过滤层析技术(gel filtration，GF)，离子交换层析技术(ion exchange，IEX)，羟基磷灰石层析(hydroxyapatite，HAP)和疏水作用层析(hydrophobic interaction，HI)，以及亲和层析和高效液相色谱方法(high-performance liquid chromatography，HPLC)。

对于一个初接触蛋白纯化的新手而言，从哪儿下手也许是令人头疼的一件事，但是幸运的是目前这些流程都已经逐步系统化了。GE Healthcare(原Amersham Biosciences)的技术顾问Andrew Mitchell解释道，通常利用液相色谱技术进行蛋白纯化有三步:

捕获——从细胞其它成份，比如DNA和RNA中分离需要的蛋白;

区分——从与目的蛋白具有相近的大小，或者相似的物理/化学特征的污染物中分离蛋白;

修饰——使分离得到的样品处于可使用状态。

这每一个纯化的步骤都有特定的色谱层析技术和最佳的beads大小。

第一步捕获步骤，也就是从细胞裂解物粗成份中分离蛋白，这需要一个具有高容量和高流量(flow rate)的填料。bead大小比较大，范围比较宽(比较于bead大小平均值)的“f

ast flow”填料比较理想，这种填料也有利于防止目标蛋白被水解——因为速度比较快。

第二步则对分辨率要求更高，需要更好的从混合物中分离需要的成份。通常bead的大小与分辨率成反比，因此在这一部中比较小的bead比较合适。吸附性的技术，比如离子交换IEX和疏水作用HI通常被用在纯化的这前两个步骤，而凝胶过滤则会留到了最后的修饰那一步，用于小体积，高浓度的样品。另外要注意，进行凝胶过滤层析时，样品的体积应该保持在柱床体积的1%到4%。

选择柱料的时候有两个因素要考虑到，针对目的蛋白的选择性和有效性——这些可以由洗脱峰的宽度来说明。其中选择性主要是指填料与目的蛋白相互作用以及结合的能力，IEX和HI层析方法就是指目标分子与筛分介质之间的相互作用，而GF的选择性依赖于填料的分馏范围(fractionation range)。

柱料的有效性则是指层析介质洗脱样品得到显著层析峰的能力，Mitchell表示，“如果你的峰值不集中，比较宽，那么即使是选择性很好，分辨率仍然会被消弱”。bead越大，洗脱峰就越不集中，柱子的有效性就越低。纯化洗脱相近的蛋白需要高效性，高选择性和高效性的结合就会得到高分辨率。

凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)

凝胶过滤法(gel filtration)也称为排阻层析(exclusion chromatography)、凝胶层析(gel chromatography)或分子筛层析(molecular sieve chromatofraphy)，它是在1960年后发展出来的技术。

凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，内部具有网状筛孔，利用球状凝胶内的筛孔，使分子流过填充凝胶的管柱时，大分子无法进入凝胶筛孔，而只流经凝胶

及管柱间的孔隙，很快就可以流出管柱，较小的分子因为进入凝胶内的筛孔，故在管柱内的停留时间较长，由此区分大小不同的分子，亦可与已知大小的分子作比较而定出一分子的分子量。一般状况下，凝胶不会吸附成份，所有欲分离物质都会被洗出，这是凝胶层析法与其它层析法不同的地方。

目前常用的凝胶包括3个主要类型:

1. Polydextran

Polydextran的商品名称是Sephadex，它几乎不溶于溶剂中，亲水性强，能迅速在水和电解质溶液中膨胀，在碱性的环境中十分稳定，所以可以用碱去除凝胶上的污染物。Sephadex依其吸水量有不同型号，如 G-25、G-75、G-100或是G-200，G 后面的数字为凝胶吸水量再乘以10，以G-25为例，表示1克干燥的G-25凝胶可以吸水2.5 ml。

GE的Sephadex G-25柱就是这一系的产品，十分适合于快速处理不同体积的样品，可以用在层析纯化的前、中、后的任一阶段，即适用于实验室操作，也可以在生产上应用。达柱体积30,的样品可通过简单的一次性上柱，脱盐并转换道新的缓冲液中，一些不需要的低分子量的物质，如盐分子就被洗脱了，这种产品最大的特点就是高速和高容量，处理起样品来快速高效。

2. Polyacrylamide

Polyacrylamide是一种合成凝胶，商品名Bio-Gel P，干粉颗粒状，在溶剂中自动溶成胶体，依胶的分离范围不同，分成Bio-Gel P-2至Bio-Gel P-300，P后面的数字乘以1000为最大过滤限度。Polyacrylamide的化学性质不活泼，但它在极端的pH 下会被水解，水解后产生的COOH-具有离子交换的性质，因此pH 值应尽量控制在2-10之间。

3. Agarose

商品名Separose，属于天然凝胶，依凝胶中干胶的百分含量，分为Sepharose 2B，4B和6B。Agarose gel 是一种大孔凝胶，主要用于像核酸或病毒这些分子量400,000以上的物质，因其颗粒软，在分离过程有时会阻塞管柱，造成流速减慢，又因其在摄氏50度以上会融化，故需于较低温的环境中进行层析。Agarose 做成beads后不能再脱水干燥，所以要在湿态中保存。

凝胶和管柱的选择:

凝胶的材质需为化学惰性，与分离物不能产生变性(denature)或是其它化学反应，最好具有能长期反复使用的稳定性，并可以在较大的pH和温度范围内使用。由于凝胶上的离子交换基团会吸附带电荷的物质，产生离子交换的效果，所以凝胶上最好不具有离子交换的基团。此外，凝胶要有一定的机械强度，在层析过程中才不会变形，增加机械强度也可使层析在较高压力的环境进行，缩短分离时间。

凝胶颗粒的粗细与分离效果有直接关系，颗粒细的分离效果好，但流速慢而费时，因此要依据实际的需要来选择。对于分子量较小的物质，一般采用polydextran或polyacrylamide材质的凝胶，大分子物质则使用agarose。

以Sephadex为例，Sephadex G-50可用于区分分子量1,500~30,000之分子，而Sephadex G-75 凝胶可区分分子量3,000~70,000之分子，所以若要分离分子量10,000及20,000之分子，两种都适用。

1的管柱，且管柱如果要分离的分子大小相差很多，则可选用柱高:直

径,5:1~15:

体积要大于4~15倍的样品体积;如果要分离的物质之间分子量差异不大，则要选用柱高:直径,20:1~100:1的管柱，且管柱体积要大于25~100倍的样品体积。

凝胶的处理:

商品凝胶一般是干燥的颗粒，使用前要先泡在欲使用的冲洗液中，使它充份膨胀，否则有引起凝胶柱破裂的危险。热胀法是常用的前处理法，即把浸于冲洗液中