蛋白纯化液相层析
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• 纸层析是指以滤纸作为基质的层析。 • 薄层层析是将纤维素等基质在玻璃或塑料等光滑表面铺成一薄层，在
薄层上进行层析。
• 纸层析和薄层层析主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离 制备，通常为一次性使用。
纸
薄
层
层
析
层
析
• 柱层析则是指将固定相基质填装在管中形成柱形，流动相流过柱子进行层析。 柱层析是常用的层析形式，适用于样品分析、分离。生物化学、高效液相色
·层析也叫色谱，英文都是Chromatography，是一种分离和分 析方法，在分析化学、生物化学等领域有着非常广泛的应用。
·利用不同物质在不同相态（一相是固定相，另一相是流动相） 的选择性分配，以流动相进行洗脱，不同的物质会以不同的速度 沿固定相移动，最终达到分离的效果。
·起源于20世纪初，1950年代后飞速发展，出现色谱学。有两位 化学家因为在色谱领域的贡献而获得诺贝尔化学奖（瑞典科学家 Tiselius1948年，英国科学家Martin和Synge1952年 ），色谱分 析方法还在12项获得诺贝尔化学奖的研究工作中起到关键作用。
尺寸排阻层析（Size Exclusion Chromatography，SEC） 分子筛层析（Molecular Sieve Chromatography，MSC）
凝胶过滤层析（Gel Filtration Chromatography，GFC） 流动相主要为水溶液
基质以交联葡聚糖为代表
生化分离分子量测定（中低压）
Polishing ，CIPP） • 凝胶过滤层析（Gel Filtration Chromatography，GFC ） • 离子交换层析（Ion Exchange Chromatography，IEC ） • 疏水相互作用层析（Hydrophobic Interaction
Chromatography，HIC ） • 反相层析（Reversed Phase Chromatography，RPC） • 亲和层析（Affinity Chromatography，AC ） • 总结
• 分辨率，高分辨率的获得是通过对色谱技术的选择和色谱介质的效率来形成 一个很窄的色谱峰。一般情况下，在样品纯化的最后阶段获得好的分辨率是 非常困难的，因为这时样品中的杂质和靶蛋白质的特性非常相似。
每一种技术都在分辨率、 容量、速度和回收率之 间达到一种平衡
• 一般来说，如果使上述4个参数中的一个参数最优化，那么将会以损 失其它3个纯化参数为代价并且纯化步骤也会受到影响。
wk.baidu.com
凝胶过滤原理：体积排阻
动画：凝胶过滤
体积大小、分子形状决定洗脱位置
检 测 值
不同分子按照大小顺序洗出 大分子先洗出，小分子后洗 出
体积
分离体积
Vo = void volume 外水体积
Vr or Ve= retention volume or elution volume 保留体积/洗脱体积
Vt = total liquid volume of the bed 总液体体积
谱等都通常采用柱层析形式。层析用的柱子大小、材质多种多样。
2、根据流动相的形式分类，层析可以分为液相层析和气相层析。 · 气相层析是指流动相为气体的层析，测定样品时需要气化，大大限制
了其在生化领域的应用，主要用于氨基酸、等小分子的分析鉴定。 · 液相层析指流动相为液体的层析，是生物领域最常用的层析形式，适
·在捕获阶段，目标是分离、浓缩和稳定目标产物。产品应当被 浓缩，并且转移到保持其能力和活性的环境中。 ·在中度纯化阶段，目标是去除大部分不纯物，如其它蛋白和核 酸、内毒素和病毒。 ·在精制阶段，除了微量或极其相关的物质，绝大多数不纯物已 经被去除。目标是去除任何残留的微量不纯物或极其相关的物质， 获得最终的纯化物。 ·依据每种纯化技术的主要优势和样品在开始纯化或者每一步骤 结束时的条件来合理的组合纯化技术。 ·通过对纯化技术的合理组合使在两个纯化步骤间的样品处理量 最小化，避免对样品使用条件的限制。
凝胶渗透层析（Gel Permeation Chromatography，GPC） 流动相为主要为非水有机溶剂
基质以聚苯乙烯二乙烯苯为代表
有机高分子分离分子量测定（高压）
组群分离，脱盐换液 分级分离，精纯
名称混乱 原理相同
凝胶过滤填料结构
琼脂糖凝胶颗粒
化学惰性 孔径控制 孔内充满流动相 柱内非流动相体积约5%
Chromatography，HIC ） • 反相层析（Reversed Phase Chromatography，RPC） • 亲和层析（Affinity Chromatography，AC ） • 总结
• 蛋白纯化一般需要考虑回答的问题： • 制备产品的目的是什么？ • 什么样的原材料是可以使用的和如何处理它？ • 纯度问题与材料的来源有什么样的关系，和终产品的
重力液相柱层析
★ 不需特殊设备 ★ 易操作 ★ 可以高通量 ★ 流速不够快也不准 ★ 不易在线监测
简单液相柱层析装置
ÄKTA系列
内容
• 层析概述 • 三步层析策略（ Capture、Intermediate Purification、
Polishing ，CIPP） • 凝胶过滤层析（Gel Filtration Chromatography，GFC ） • 离子交换层析（Ion Exchange Chromatography，IEC ） • 疏水相互作用层析（Hydrophobic Interaction
• 正相层析，属于分配层析，固定相极性大于流动相。 • 正相键合相层析，固定相共价键合在固定基质上的正相层析。 • 反相层析，属于分配层析，固定相极性小于流动相。 • 反相键合相层析，固定相共价键合在固定基质上的反相层析。 • 凝胶过滤层析，属于分子筛层析，流动相主要为水溶液。 • 凝胶渗透层析，属于分子筛层析，流动相主要为有机溶液。
大肠杆菌的超声前（左） 后（右）镜检照片
2、离心 • 以离心加速度为评价标准，而不是以离心速度为标准。 • 相对加速度公式=ω2r/g， ω为角速度，r为离心半径（平均值）。 3、过滤 • 微滤、超滤，切向流或死端，样品至少用0.45μm孔径滤膜（HPLC
0.2微米）。
内容
• 层析概述 • 三步层析策略（ Capture、Intermediate Purification、
• 不要拘泥于各种分类方法。 • 液固液液层析等叫法在中低压层析不常用。 • 蛋白纯化层析都属于液相柱层析，分子筛层析、离子交换
层析、疏水相互作用层析、亲和层析、反相层析是最常用 叫法。
层析过程
• 装柱：重力装柱、正压装柱，软胶、半硬胶装柱压力不同。 柱效测定。
• 加样：注意允许的体积、浓度、总量。 • 洗脱：等度洗脱、梯度洗脱 • 流动相动力：重力，泵。 • 检测：紫外检测器（VWD、DAD）、荧光检测器 • 数据记录：记录仪（有纸、无纸）、电脑 • 馏分收集：馏分收集器
• 每一个纯化参数的重要性是变化的，这主要取决于一个纯化步骤是否 用于捕获、中度纯化或者精细纯化阶段。
比如回收率
样品前处理
1、超声破碎 • 防止能量太大，产热过盛，蛋白发生炭化，但变黑的原因还有含杂质化学
试剂作用等等。 • 起泡使蛋白溶液易溅出而且位于泡沫表面的蛋白易变性，影响最终得率。
防止方法：一定要将末端插入液面下较深部位，防止与空气物质接触，产 生气泡；每次超声的菌液量要适中。 • 离心后沉淀再重复超声破碎一次，合并两次上清液。 • 超声破碎有一个最适合的菌液浓度（例如100mg/mL）。 • 占空比：超声为恒定周期的方波，设开关管的导通时间为Ton，开关管的 关闭时间为Toff，脉冲周期为T，则占空比为Ton：T。
蛋白纯化-液相柱层析简介
生药所姜松
内容
• 层析概述 • 三步层析策略（ Capture、Intermediate Purification、
Polishing ，CIPP） • 凝胶过滤层析（Gel Filtration Chromatography，GFC ） • 离子交换层析（Ion Exchange Chromatography，IEC ） • 疏水相互作用层析（Hydrophobic Interaction
4、其它的分类 • 液固层析，也叫吸附层析，部分正相层析属于液固层析。 • 液液层析，属于分配层析。作为固定相的固定液是机械涂布在固定基
质本体上的。固定相易流失，现少使用。
• 键合相层析，属于分配层析，作为固定相的固定液是以化学键共价连 接到固定基质本体上的，固定相稳定不易流失，类比液液层析。有些 极性分子键合到固定基质本体上，整体可以把固定相看作固体，类比 液固层析。
预期使用有什么联系？
• 什么东西必须去除？ • 什么东西必须完全去除？ • 最终纯化的规模是什么？ • 如果需要扩大规模，用已选择的纯化技术将会产生什
么样的后果？
• 在经济方面的限制是什么？ • 什么样的资源和设备是可以利用的？
三步纯化策略CIPP
Capture Intermediate Purification Polishing
Chromatography，HIC ） • 反相层析（Reversed Phase Chromatography，RPC） • 亲和层析（Affinity Chromatography，AC ） • 总结
内容
• 层析概述 • 三步层析策略（ Capture、Intermediate Purification、
• 疏水相互作用层析是以疏水基团为固定相，根据物质的疏水能力不同 进行分离的一种层析技术。
• 亲和层析是根据生物大分子和配体之间的特异性亲和力（如酶和抑制 剂、抗体和抗原、激素和受体等），将某种配体连接在载体上作为固 定相，而对能与配体特异性结合的生物大分子进行分离的一种层析技 术。亲和层析是分离生物大分子最为有效的层析技术。
于生物样品的分析、分离。
作为固定相支持物的毛细 管，很细很长。 液体固定相涂布在毛细管 内壁，气体流动相流过管 内。 样品也需要气化。
3、根据分离的原理不同分类，层析主要可以分为吸附层析、分配层析、 分子筛层析、离子交换层析、疏水相互作用层析、亲和层析等。
• 吸附层析是以固体吸附剂为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附 力不同而达到分离目的的一种层析技术。
• 分配层析是以载带在固相本体的固定液为固定相，不同物质在固定相 和流动相的分配性能不同而达到分离目的的一种层析技术。
• 分子筛层析是以化学惰性的多空凝胶颗粒作为固定相，根据物质的分 子大小进行分离的一种层析技术。
• 离子交换层析是以离子交换剂为固定相，根据物质的带电性质不同而 进行分离的一种层析技术。
• 容量，纯化过程中加载靶蛋白的总量。在一些情况下，加载样品的总量或许 会受到上样体积的限制（如在凝胶过滤色谱中）或者受到大量存在于样品中 的污染物的限制，而不是靶蛋白的总量的限制。
• 速度，在开始纯化阶段速度是一个最重要的环节，需要尽可能快的将样品中 的污染物如蛋白酶等必须去除的物质除去。
• 回收率，在整个纯化的进程中，回收率的重要性会逐渐增加，因为被纯化产 品的价值在逐渐增加。回收率受到对样品破坏过程的影响和不适宜色谱柱条 件的影响。
Polishing ，CIPP） • 凝胶过滤层析（Gel Filtration Chromatography，GFC ） • 离子交换层析（Ion Exchange Chromatography，IEC ） • 疏水相互作用层析（Hydrophobic Interaction
Chromatography，HIC ） • 反相层析（Reversed Phase Chromatography，RPC） • 亲和层析（Affinity Chromatography，AC ） • 总结
俄国植物学家米哈伊尔·茨维特-色谱学之父 茨维特奖-色谱界大奖
1906年茨维特用碳酸钙填充竖 立的玻璃管，以石油醚洗脱植 物色素的提取液，植物色素在 碳酸钙柱中实现分离。由于这 一实验将混合的植物色素分离 为不同的色带，因此他将这种 方法命名色谱法。
层析法的分类
1、根据固定相基质的形式分类，层析可以分为纸层析、薄层层析、毛 细管层析和柱层析。
薄层上进行层析。
• 纸层析和薄层层析主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离 制备，通常为一次性使用。
纸
薄
层
层
析
层
析
• 柱层析则是指将固定相基质填装在管中形成柱形，流动相流过柱子进行层析。 柱层析是常用的层析形式，适用于样品分析、分离。生物化学、高效液相色
·层析也叫色谱，英文都是Chromatography，是一种分离和分 析方法，在分析化学、生物化学等领域有着非常广泛的应用。
·利用不同物质在不同相态（一相是固定相，另一相是流动相） 的选择性分配，以流动相进行洗脱，不同的物质会以不同的速度 沿固定相移动，最终达到分离的效果。
·起源于20世纪初，1950年代后飞速发展，出现色谱学。有两位 化学家因为在色谱领域的贡献而获得诺贝尔化学奖（瑞典科学家 Tiselius1948年，英国科学家Martin和Synge1952年 ），色谱分 析方法还在12项获得诺贝尔化学奖的研究工作中起到关键作用。
尺寸排阻层析（Size Exclusion Chromatography，SEC） 分子筛层析（Molecular Sieve Chromatography，MSC）
凝胶过滤层析（Gel Filtration Chromatography，GFC） 流动相主要为水溶液
基质以交联葡聚糖为代表
生化分离分子量测定（中低压）
Polishing ，CIPP） • 凝胶过滤层析（Gel Filtration Chromatography，GFC ） • 离子交换层析（Ion Exchange Chromatography，IEC ） • 疏水相互作用层析（Hydrophobic Interaction
Chromatography，HIC ） • 反相层析（Reversed Phase Chromatography，RPC） • 亲和层析（Affinity Chromatography，AC ） • 总结
• 分辨率，高分辨率的获得是通过对色谱技术的选择和色谱介质的效率来形成 一个很窄的色谱峰。一般情况下，在样品纯化的最后阶段获得好的分辨率是 非常困难的，因为这时样品中的杂质和靶蛋白质的特性非常相似。
每一种技术都在分辨率、 容量、速度和回收率之 间达到一种平衡
• 一般来说，如果使上述4个参数中的一个参数最优化，那么将会以损 失其它3个纯化参数为代价并且纯化步骤也会受到影响。
wk.baidu.com
凝胶过滤原理：体积排阻
动画：凝胶过滤
体积大小、分子形状决定洗脱位置
检 测 值
不同分子按照大小顺序洗出 大分子先洗出，小分子后洗 出
体积
分离体积
Vo = void volume 外水体积
Vr or Ve= retention volume or elution volume 保留体积/洗脱体积
Vt = total liquid volume of the bed 总液体体积
谱等都通常采用柱层析形式。层析用的柱子大小、材质多种多样。
2、根据流动相的形式分类，层析可以分为液相层析和气相层析。 · 气相层析是指流动相为气体的层析，测定样品时需要气化，大大限制
了其在生化领域的应用，主要用于氨基酸、等小分子的分析鉴定。 · 液相层析指流动相为液体的层析，是生物领域最常用的层析形式，适
·在捕获阶段，目标是分离、浓缩和稳定目标产物。产品应当被 浓缩，并且转移到保持其能力和活性的环境中。 ·在中度纯化阶段，目标是去除大部分不纯物，如其它蛋白和核 酸、内毒素和病毒。 ·在精制阶段，除了微量或极其相关的物质，绝大多数不纯物已 经被去除。目标是去除任何残留的微量不纯物或极其相关的物质， 获得最终的纯化物。 ·依据每种纯化技术的主要优势和样品在开始纯化或者每一步骤 结束时的条件来合理的组合纯化技术。 ·通过对纯化技术的合理组合使在两个纯化步骤间的样品处理量 最小化，避免对样品使用条件的限制。
凝胶渗透层析（Gel Permeation Chromatography，GPC） 流动相为主要为非水有机溶剂
基质以聚苯乙烯二乙烯苯为代表
有机高分子分离分子量测定（高压）
组群分离，脱盐换液 分级分离，精纯
名称混乱 原理相同
凝胶过滤填料结构
琼脂糖凝胶颗粒
化学惰性 孔径控制 孔内充满流动相 柱内非流动相体积约5%
Chromatography，HIC ） • 反相层析（Reversed Phase Chromatography，RPC） • 亲和层析（Affinity Chromatography，AC ） • 总结
• 蛋白纯化一般需要考虑回答的问题： • 制备产品的目的是什么？ • 什么样的原材料是可以使用的和如何处理它？ • 纯度问题与材料的来源有什么样的关系，和终产品的
重力液相柱层析
★ 不需特殊设备 ★ 易操作 ★ 可以高通量 ★ 流速不够快也不准 ★ 不易在线监测
简单液相柱层析装置
ÄKTA系列
内容
• 层析概述 • 三步层析策略（ Capture、Intermediate Purification、
Polishing ，CIPP） • 凝胶过滤层析（Gel Filtration Chromatography，GFC ） • 离子交换层析（Ion Exchange Chromatography，IEC ） • 疏水相互作用层析（Hydrophobic Interaction
• 正相层析，属于分配层析，固定相极性大于流动相。 • 正相键合相层析，固定相共价键合在固定基质上的正相层析。 • 反相层析，属于分配层析，固定相极性小于流动相。 • 反相键合相层析，固定相共价键合在固定基质上的反相层析。 • 凝胶过滤层析，属于分子筛层析，流动相主要为水溶液。 • 凝胶渗透层析，属于分子筛层析，流动相主要为有机溶液。
大肠杆菌的超声前（左） 后（右）镜检照片
2、离心 • 以离心加速度为评价标准，而不是以离心速度为标准。 • 相对加速度公式=ω2r/g， ω为角速度，r为离心半径（平均值）。 3、过滤 • 微滤、超滤，切向流或死端，样品至少用0.45μm孔径滤膜（HPLC
0.2微米）。
内容
• 层析概述 • 三步层析策略（ Capture、Intermediate Purification、
• 不要拘泥于各种分类方法。 • 液固液液层析等叫法在中低压层析不常用。 • 蛋白纯化层析都属于液相柱层析，分子筛层析、离子交换
层析、疏水相互作用层析、亲和层析、反相层析是最常用 叫法。
层析过程
• 装柱：重力装柱、正压装柱，软胶、半硬胶装柱压力不同。 柱效测定。
• 加样：注意允许的体积、浓度、总量。 • 洗脱：等度洗脱、梯度洗脱 • 流动相动力：重力，泵。 • 检测：紫外检测器（VWD、DAD）、荧光检测器 • 数据记录：记录仪（有纸、无纸）、电脑 • 馏分收集：馏分收集器
• 每一个纯化参数的重要性是变化的，这主要取决于一个纯化步骤是否 用于捕获、中度纯化或者精细纯化阶段。
比如回收率
样品前处理
1、超声破碎 • 防止能量太大，产热过盛，蛋白发生炭化，但变黑的原因还有含杂质化学
试剂作用等等。 • 起泡使蛋白溶液易溅出而且位于泡沫表面的蛋白易变性，影响最终得率。
防止方法：一定要将末端插入液面下较深部位，防止与空气物质接触，产 生气泡；每次超声的菌液量要适中。 • 离心后沉淀再重复超声破碎一次，合并两次上清液。 • 超声破碎有一个最适合的菌液浓度（例如100mg/mL）。 • 占空比：超声为恒定周期的方波，设开关管的导通时间为Ton，开关管的 关闭时间为Toff，脉冲周期为T，则占空比为Ton：T。
蛋白纯化-液相柱层析简介
生药所姜松
内容
• 层析概述 • 三步层析策略（ Capture、Intermediate Purification、
Polishing ，CIPP） • 凝胶过滤层析（Gel Filtration Chromatography，GFC ） • 离子交换层析（Ion Exchange Chromatography，IEC ） • 疏水相互作用层析（Hydrophobic Interaction
4、其它的分类 • 液固层析，也叫吸附层析，部分正相层析属于液固层析。 • 液液层析，属于分配层析。作为固定相的固定液是机械涂布在固定基
质本体上的。固定相易流失，现少使用。
• 键合相层析，属于分配层析，作为固定相的固定液是以化学键共价连 接到固定基质本体上的，固定相稳定不易流失，类比液液层析。有些 极性分子键合到固定基质本体上，整体可以把固定相看作固体，类比 液固层析。
预期使用有什么联系？
• 什么东西必须去除？ • 什么东西必须完全去除？ • 最终纯化的规模是什么？ • 如果需要扩大规模，用已选择的纯化技术将会产生什
么样的后果？
• 在经济方面的限制是什么？ • 什么样的资源和设备是可以利用的？
三步纯化策略CIPP
Capture Intermediate Purification Polishing
Chromatography，HIC ） • 反相层析（Reversed Phase Chromatography，RPC） • 亲和层析（Affinity Chromatography，AC ） • 总结
内容
• 层析概述 • 三步层析策略（ Capture、Intermediate Purification、
• 疏水相互作用层析是以疏水基团为固定相，根据物质的疏水能力不同 进行分离的一种层析技术。
• 亲和层析是根据生物大分子和配体之间的特异性亲和力（如酶和抑制 剂、抗体和抗原、激素和受体等），将某种配体连接在载体上作为固 定相，而对能与配体特异性结合的生物大分子进行分离的一种层析技 术。亲和层析是分离生物大分子最为有效的层析技术。
于生物样品的分析、分离。
作为固定相支持物的毛细 管，很细很长。 液体固定相涂布在毛细管 内壁，气体流动相流过管 内。 样品也需要气化。
3、根据分离的原理不同分类，层析主要可以分为吸附层析、分配层析、 分子筛层析、离子交换层析、疏水相互作用层析、亲和层析等。
• 吸附层析是以固体吸附剂为固定相，根据待分离物与吸附剂之间吸附 力不同而达到分离目的的一种层析技术。
• 分配层析是以载带在固相本体的固定液为固定相，不同物质在固定相 和流动相的分配性能不同而达到分离目的的一种层析技术。
• 分子筛层析是以化学惰性的多空凝胶颗粒作为固定相，根据物质的分 子大小进行分离的一种层析技术。
• 离子交换层析是以离子交换剂为固定相，根据物质的带电性质不同而 进行分离的一种层析技术。
• 容量，纯化过程中加载靶蛋白的总量。在一些情况下，加载样品的总量或许 会受到上样体积的限制（如在凝胶过滤色谱中）或者受到大量存在于样品中 的污染物的限制，而不是靶蛋白的总量的限制。
• 速度，在开始纯化阶段速度是一个最重要的环节，需要尽可能快的将样品中 的污染物如蛋白酶等必须去除的物质除去。
• 回收率，在整个纯化的进程中，回收率的重要性会逐渐增加，因为被纯化产 品的价值在逐渐增加。回收率受到对样品破坏过程的影响和不适宜色谱柱条 件的影响。
Polishing ，CIPP） • 凝胶过滤层析（Gel Filtration Chromatography，GFC ） • 离子交换层析（Ion Exchange Chromatography，IEC ） • 疏水相互作用层析（Hydrophobic Interaction
Chromatography，HIC ） • 反相层析（Reversed Phase Chromatography，RPC） • 亲和层析（Affinity Chromatography，AC ） • 总结
俄国植物学家米哈伊尔·茨维特-色谱学之父 茨维特奖-色谱界大奖
1906年茨维特用碳酸钙填充竖 立的玻璃管，以石油醚洗脱植 物色素的提取液，植物色素在 碳酸钙柱中实现分离。由于这 一实验将混合的植物色素分离 为不同的色带，因此他将这种 方法命名色谱法。
层析法的分类
1、根据固定相基质的形式分类，层析可以分为纸层析、薄层层析、毛 细管层析和柱层析。