PDX模型的建立、分析和应用
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– 肿瘤的多样化和异质性 – 研究模型与临床病人缺乏相关性
3
PDX模型技术流程图
Modified Fig from Oncodesign Biotechnology 4
为什么使用PDX模型？
• 优势
– 没有体外培养的过程对肿瘤进行“筛选” – 能搞保持肿瘤原有特性和异质性 – 在传代过程中能够保持分子生物学水平的稳定 – 保留了原有的非肿瘤基质和微环境 – 可以对多种状态下病人来源的肿瘤进行研究
肿瘤接种
• 使用套针(Trochar)进行皮下肿瘤接种
Xiaomei Zhang, et al. Current Protocols in Mouse Biology 2013 12
肿瘤接种
• 原位接种
– 常用途径：肾包膜下接种(Sub-Renal Capsule, SRC)
Peter Eirew, et al. Nature Protocols 2010
13
肿瘤组织的冻存和复苏
• 冻存液
– 胎牛血清 + 10% DMSO
• 保存条件
– -80oC：6周 – 液氮：长期保存
• 从冻存条件下复苏
– 37oC水浴快速解冻
14
肿瘤组织的冻存和复苏
• 通过冻存和复苏可以：
– 在获得患者知情同意书之前保存样本 – 保有备份样本进行重复实验
15
• PDX模型的建立 • PDX模型的分析 • PDX模型的应用
– 建立和维持的成本较高
• 相对的建成之后的使用价值也非常高
6
• PDX模型的建立 • PDX模型的分析 • PDX模型的应用
7
PDX模型的建立
• 关键点
– 肿瘤宿主 – 肿瘤接种 – 肿瘤的冻存和复苏
8
宿主品系
小鼠品系
免疫缺陷
Nude
T淋巴细胞严重缺失
SCID
Severe Combined Immunodeficiency
神经内分泌前列腺癌PDX模型维持了原瘤的蛋白标记
Dong Lin, et al. Cancer Res 2013 21
分析内容 – 组织学
• 组织芯片(Tissue Micro-Array , TMA)
Guido Sauter, et al. Nature Review Drug Discovery 2003 22
新
1
传统模型：肿瘤细胞系
• 可以很方便的在体外进行培养和实验 • 缺点：
– 在培养和传代过程中进行“筛选”，肿瘤细胞 逐渐适应体外培养环境而失去原有特性
– 缺乏肿瘤相关的生长环境
• 支持性的非肿瘤基质 • 血液细胞，免疫系统的交互 • 其他肿瘤微环境因子
2
肿瘤研究模型
• 使用传统的肿瘤研究模型没能取得临床上 的成功！
– 整理过的基因突变数据
23
分析内容 – 分子水平
• 外显子组测序
– 外显子捕获
• Roche SeqCap EZ • Agilent SureSelect • Illumina TruSeq
– 原瘤 vs. 移植瘤
19
分析内容 – 组织学
• 病理学染色（HE染色）
– 确认肿瘤组织结构
头颈癌PDX模型维持了原瘤的组织学特性
Peng et al. Journal of Translational Medicine 2013 20
分析内容 – 组织学
• 免疫组织化学染色 （IHC）
– 常规标记（如细胞增殖、凋亡） – 移植的生物标记物（Her2, EGFR, KRAS等蛋白） – 研究者感兴趣的蛋白
人源肿瘤异种移植(PDX)模型的建立、 分析和应用
Fei Zhou
肿瘤研究模型
• 多样化的肿瘤研究模型
– 病人肿瘤组织/原代肿瘤细胞 – 永生化的肿瘤细胞系
• 2D和3D的细胞生物学实验方法（增殖/存活） • 来源于肿瘤细胞系的移植模型
–
来源于病人肿瘤组织的移植(PDX)模型 Patient Derived Tumor Xenograft
T淋巴细胞和B淋巴细胞缺失
NOD-SCID
Non-obese Diabetic SCID
与普通SCID相比NK细胞活性低， 更低的免疫恢复几率
NSG
NOD-SCID-IL2Rγ-/-
缺失T淋巴细胞，B淋巴细胞和NK 细胞
9
宿主品系
• 目前并没有针对不同品系宿主的完整比较
– 移植瘤生长时间 – 接种成功率 – 移植瘤遗传学特性 – 移植瘤组织学特性 – 移植瘤传代的稳定性
• 模型建立情况与肿瘤类型相关 • 荷瘤小鼠的饲养
• 设施要求（常规为SPF级IVC饲养） • 完善的IACUC政策
10
• 皮下接种
肿瘤接种
Norman E. Sharpless and Ronald A. DePinho, et al. Nature Review Drug Discovery 2006 11
PDX模型和肿瘤病人有更好的对应性！
5
使用PDX模型
• 劣势
– 仍然不能模拟肿瘤与免疫系统的交互
• 可以在NSG小鼠模型中部分重建人源免疫系统
– 在传代过程中模型的非肿瘤基质会被鼠源的基质逐 渐取代
• 使用较低代数的PDX模型进行研究
– 需要相对便捷的临床肿瘤样本来源 – 技术水平上有挑战性
• 移植 + 分析（包括生物信息学平台）
16ห้องสมุดไป่ตู้
PDX模型的分析
• 目的
• 说明移植瘤与原瘤的相似性 • 确认移植瘤在传代过程中的生物学稳定 • 为PDX模型的应用提供数据支撑
17
需要保存的材料
• 基因组DNA
– 使用代表性的肿瘤组织区域进行DNA提取
– 如：排除坏死区域等
– 冷冻保存
• 总RNA
– 避免RNA酶污染，一般用试剂盒小心提取，冷冻保存
– 包含mRNA和miRNA
• 蛋白样本（组织裂解液）
– 处理时包含蛋白酶和磷酸酶抑制剂
– 冷冻保存
生物样本库
18
分析内容 – 常规
• 临床背景
– 患者年龄/性别； – 肿瘤类别，原位瘤/转移瘤； – 治疗史
• 移植瘤分析
– 生长曲线； – 药理学特性
• 针对特定药物处理的反应
• 组织学和分子生物学分析
分析内容 – 分子水平
• DNA
– 基因序列
• 第二代测序平台：Illumina HiSeq等
– 基因突变
• Sequenom OncoCarta™ Panels V1-3
– V1：涵盖19个常规癌基因的238个突变位点 – V2：涵盖18个癌基因或癌抑制基因的152 个突变位点 – V3:：涵盖22个癌基因的105个突变位点
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PDX模型技术流程图
Modified Fig from Oncodesign Biotechnology 4
为什么使用PDX模型？
• 优势
– 没有体外培养的过程对肿瘤进行“筛选” – 能搞保持肿瘤原有特性和异质性 – 在传代过程中能够保持分子生物学水平的稳定 – 保留了原有的非肿瘤基质和微环境 – 可以对多种状态下病人来源的肿瘤进行研究
肿瘤接种
• 使用套针(Trochar)进行皮下肿瘤接种
Xiaomei Zhang, et al. Current Protocols in Mouse Biology 2013 12
肿瘤接种
• 原位接种
– 常用途径：肾包膜下接种(Sub-Renal Capsule, SRC)
Peter Eirew, et al. Nature Protocols 2010
13
肿瘤组织的冻存和复苏
• 冻存液
– 胎牛血清 + 10% DMSO
• 保存条件
– -80oC：6周 – 液氮：长期保存
• 从冻存条件下复苏
– 37oC水浴快速解冻
14
肿瘤组织的冻存和复苏
• 通过冻存和复苏可以：
– 在获得患者知情同意书之前保存样本 – 保有备份样本进行重复实验
15
• PDX模型的建立 • PDX模型的分析 • PDX模型的应用
– 建立和维持的成本较高
• 相对的建成之后的使用价值也非常高
6
• PDX模型的建立 • PDX模型的分析 • PDX模型的应用
7
PDX模型的建立
• 关键点
– 肿瘤宿主 – 肿瘤接种 – 肿瘤的冻存和复苏
8
宿主品系
小鼠品系
免疫缺陷
Nude
T淋巴细胞严重缺失
SCID
Severe Combined Immunodeficiency
神经内分泌前列腺癌PDX模型维持了原瘤的蛋白标记
Dong Lin, et al. Cancer Res 2013 21
分析内容 – 组织学
• 组织芯片(Tissue Micro-Array , TMA)
Guido Sauter, et al. Nature Review Drug Discovery 2003 22
新
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传统模型：肿瘤细胞系
• 可以很方便的在体外进行培养和实验 • 缺点：
– 在培养和传代过程中进行“筛选”，肿瘤细胞 逐渐适应体外培养环境而失去原有特性
– 缺乏肿瘤相关的生长环境
• 支持性的非肿瘤基质 • 血液细胞，免疫系统的交互 • 其他肿瘤微环境因子
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肿瘤研究模型
• 使用传统的肿瘤研究模型没能取得临床上 的成功！
– 整理过的基因突变数据
23
分析内容 – 分子水平
• 外显子组测序
– 外显子捕获
• Roche SeqCap EZ • Agilent SureSelect • Illumina TruSeq
– 原瘤 vs. 移植瘤
19
分析内容 – 组织学
• 病理学染色（HE染色）
– 确认肿瘤组织结构
头颈癌PDX模型维持了原瘤的组织学特性
Peng et al. Journal of Translational Medicine 2013 20
分析内容 – 组织学
• 免疫组织化学染色 （IHC）
– 常规标记（如细胞增殖、凋亡） – 移植的生物标记物（Her2, EGFR, KRAS等蛋白） – 研究者感兴趣的蛋白
人源肿瘤异种移植(PDX)模型的建立、 分析和应用
Fei Zhou
肿瘤研究模型
• 多样化的肿瘤研究模型
– 病人肿瘤组织/原代肿瘤细胞 – 永生化的肿瘤细胞系
• 2D和3D的细胞生物学实验方法（增殖/存活） • 来源于肿瘤细胞系的移植模型
–
来源于病人肿瘤组织的移植(PDX)模型 Patient Derived Tumor Xenograft
T淋巴细胞和B淋巴细胞缺失
NOD-SCID
Non-obese Diabetic SCID
与普通SCID相比NK细胞活性低， 更低的免疫恢复几率
NSG
NOD-SCID-IL2Rγ-/-
缺失T淋巴细胞，B淋巴细胞和NK 细胞
9
宿主品系
• 目前并没有针对不同品系宿主的完整比较
– 移植瘤生长时间 – 接种成功率 – 移植瘤遗传学特性 – 移植瘤组织学特性 – 移植瘤传代的稳定性
• 模型建立情况与肿瘤类型相关 • 荷瘤小鼠的饲养
• 设施要求（常规为SPF级IVC饲养） • 完善的IACUC政策
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• 皮下接种
肿瘤接种
Norman E. Sharpless and Ronald A. DePinho, et al. Nature Review Drug Discovery 2006 11
PDX模型和肿瘤病人有更好的对应性！
5
使用PDX模型
• 劣势
– 仍然不能模拟肿瘤与免疫系统的交互
• 可以在NSG小鼠模型中部分重建人源免疫系统
– 在传代过程中模型的非肿瘤基质会被鼠源的基质逐 渐取代
• 使用较低代数的PDX模型进行研究
– 需要相对便捷的临床肿瘤样本来源 – 技术水平上有挑战性
• 移植 + 分析（包括生物信息学平台）
16ห้องสมุดไป่ตู้
PDX模型的分析
• 目的
• 说明移植瘤与原瘤的相似性 • 确认移植瘤在传代过程中的生物学稳定 • 为PDX模型的应用提供数据支撑
17
需要保存的材料
• 基因组DNA
– 使用代表性的肿瘤组织区域进行DNA提取
– 如：排除坏死区域等
– 冷冻保存
• 总RNA
– 避免RNA酶污染，一般用试剂盒小心提取，冷冻保存
– 包含mRNA和miRNA
• 蛋白样本（组织裂解液）
– 处理时包含蛋白酶和磷酸酶抑制剂
– 冷冻保存
生物样本库
18
分析内容 – 常规
• 临床背景
– 患者年龄/性别； – 肿瘤类别，原位瘤/转移瘤； – 治疗史
• 移植瘤分析
– 生长曲线； – 药理学特性
• 针对特定药物处理的反应
• 组织学和分子生物学分析
分析内容 – 分子水平
• DNA
– 基因序列
• 第二代测序平台：Illumina HiSeq等
– 基因突变
• Sequenom OncoCarta™ Panels V1-3
– V1：涵盖19个常规癌基因的238个突变位点 – V2：涵盖18个癌基因或癌抑制基因的152 个突变位点 – V3:：涵盖22个癌基因的105个突变位点