第五章固定化酶和细胞
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
固定化技术 第五章固定化酶和细胞
Contents of chapter 5
Go 1、什么是固定化技术和固定化酶 Go 2、固定化酶的研究历史 Go 3、酶的固定化技术 Go 4、固定化酶的特点 Go 5、固定化酶的应用
6、细胞、原生质体的固定化，自学
第五章固定化酶和细胞
1 什么是固定化酶？
水溶性酶
水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶 （固定化酶）
第五章固定化酶和细胞
酶的固定化技术和固定化酶
可溶
酶 固定化
间歇
吸附
包埋
交联
化学偶联
间歇
第五章固定化酶和细胞
连续
固定化酶的三种形式
➢固定化酶：经提取和分离纯化后的酶
➢固定化菌体(死细胞)：含酶菌体或菌体碎片
➢固定化细胞：在一定的空间范围内进行生命活动的细胞
随着固定化技术的发展，出现固定化菌体 。1973年， 日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬 氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。
在固定化酶和固定化菌体的基础上，70年代后期出现了 固定化细胞技术。 1976年，法国首次用固定化酵母细 胞生产啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草杆菌生产 淀粉酶，开始了用固定化细胞生产酶的先例。
60年代后期，固定化技术迅速发展起来。1969年，日本的 千烟一郎首次在工业上生产应用固定化氨基酰化酶从DL氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。
在1971年召开的第一次国际酶工程学术会议上，确定固定 化酶的统一英文名称为Immobilized enzyme。
第五章固定化酶和细胞
优点： 1. 不溶于水，易于与产物分离； 2. 可反复使用； 3. 可连续化生产； 4. 稳定性好。
缺点： 1.固定化过程中往往会引起酶的失活 2.固定化酶在化学催第五化章固反定化应酶和中细胞存在空间位阻
2 固定化酶的研究历史
固定化酶的研究从50年代开始，1953年德国的 Grubhofer 和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体与羧肽酶、淀粉 酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成固定化酶。
共价键结合法：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法称为共价键结
合法。共价键结合法所采用的载体主要有：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖 凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物等。 酶分子中可以形成共价键的基团主要有：氨基、羧基、巯基、羟基、酚基 和咪唑基等。要使载体与酶形成共第五价章固键定化，酶必和细须胞 首先使载体活化，
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1982年，日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸， 取得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的障碍， 更有利于胞内物质的分泌，这为胞内酶生产技术路线的 变革提供了新的方向。
第五章固定化酶和细胞
本章 目录
3 酶固定化技术
固定化酶操作的注意事项 活性中心：保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的
氨基酸基团固有的高级结构不受到损害，在制备固定 化酶时，需要在非常严密的条件下进行。 功能基团：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、 组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的 羟基等，当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求 不参与酶的固定化结合 酶的高级结构：要避免用高温、强酸、强碱等处理， 而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，因 此，操作应尽量在非常温和的条件下进行。
颗粒大小可实时监控
第五章固定化酶和细胞
脂质体包裹酶
第五章固定化酶和细胞
结合法
选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的 固定化方法。
根据酶与载体结合的化学键不同，可分为：
离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子 键结合法。离子键结合法所使用的载体是某些不溶于水的离子交换 剂。常用的有DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。
由于靠物理吸附作用，结合力 较弱，酶与载体结合不牢固而容易 脱落，所以使用受到一定的限制。
第五章固定化酶和细胞
包埋法
将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶 固定化的方法。
包埋法使用的多孔载体主要有：琼脂、琼脂 糖、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺、 光交联树脂、聚酰胺、火棉胶等。
根据载体材料和方法的不同，可分为：
Chapter 5 Immobilized Enzyme and Cell
固定化酶和细胞
第五章固定化酶和细胞
酶应用过程中的主要瓶颈
酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶，如α-淀粉酶、Taq酶等；和 胃蛋白酶等可以耐受较低的pH条件以外，大多数的酶在高温、强酸、 强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活。
凝胶包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定 形状的固定化酶或固定化含酶菌体。大多数为球状或片状，也可按需要 制成其他形状。常用的凝胶有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明 胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成凝胶。
半透膜包埋法：将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成固 定化酶。常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等
第五章固定化酶和细胞
酶和细胞固定化的模式
第五章固定化酶和细胞
吸附法
利用各种固体吸附剂将酶或含 酶菌体吸附在其表面上，而使酶固 定化的方法。
常用的固体吸附剂有活性炭、 氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔 玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。
操作简便，条件温和，不会引 起酶变性失活，载体廉价易得，而 且可反复使用。
第五章固定化酶和细胞
首先被采用包埋法的酶有：
• 固定化胰蛋白酶 • 固定化木瓜蛋白酶 • 固定化－淀粉酶 Enzyme+N,N-甲叉双丙烯酰胺，丙烯酰胺，引发 剂
第五章固定化酶和细胞
海藻酸钙包埋法装置
将水溶性的海藻酸钠配成水溶液， 并把酶或细胞分散在其中，然后将 其滴入凝固浴中（常用CaCl2 溶 液），使海藻酸钠中的Na+，部分 被Ca2+所取代而形成由多价离子交 联的离子网络凝胶。
酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系 统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力， 也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高， 而且难于连续化生产。
产物的分离纯化较困难：酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给 产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。
Contents of chapter 5
Go 1、什么是固定化技术和固定化酶 Go 2、固定化酶的研究历史 Go 3、酶的固定化技术 Go 4、固定化酶的特点 Go 5、固定化酶的应用
6、细胞、原生质体的固定化，自学
第五章固定化酶和细胞
1 什么是固定化酶？
水溶性酶
水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶 （固定化酶）
第五章固定化酶和细胞
酶的固定化技术和固定化酶
可溶
酶 固定化
间歇
吸附
包埋
交联
化学偶联
间歇
第五章固定化酶和细胞
连续
固定化酶的三种形式
➢固定化酶：经提取和分离纯化后的酶
➢固定化菌体(死细胞)：含酶菌体或菌体碎片
➢固定化细胞：在一定的空间范围内进行生命活动的细胞
随着固定化技术的发展，出现固定化菌体 。1973年， 日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬 氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。
在固定化酶和固定化菌体的基础上，70年代后期出现了 固定化细胞技术。 1976年，法国首次用固定化酵母细 胞生产啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草杆菌生产 淀粉酶，开始了用固定化细胞生产酶的先例。
60年代后期，固定化技术迅速发展起来。1969年，日本的 千烟一郎首次在工业上生产应用固定化氨基酰化酶从DL氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。
在1971年召开的第一次国际酶工程学术会议上，确定固定 化酶的统一英文名称为Immobilized enzyme。
第五章固定化酶和细胞
优点： 1. 不溶于水，易于与产物分离； 2. 可反复使用； 3. 可连续化生产； 4. 稳定性好。
缺点： 1.固定化过程中往往会引起酶的失活 2.固定化酶在化学催第五化章固反定化应酶和中细胞存在空间位阻
2 固定化酶的研究历史
固定化酶的研究从50年代开始，1953年德国的 Grubhofer 和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体与羧肽酶、淀粉 酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成固定化酶。
共价键结合法：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法称为共价键结
合法。共价键结合法所采用的载体主要有：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖 凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物等。 酶分子中可以形成共价键的基团主要有：氨基、羧基、巯基、羟基、酚基 和咪唑基等。要使载体与酶形成共第五价章固键定化，酶必和细须胞 首先使载体活化，
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1982年，日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸， 取得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的障碍， 更有利于胞内物质的分泌，这为胞内酶生产技术路线的 变革提供了新的方向。
第五章固定化酶和细胞
本章 目录
3 酶固定化技术
固定化酶操作的注意事项 活性中心：保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的
氨基酸基团固有的高级结构不受到损害，在制备固定 化酶时，需要在非常严密的条件下进行。 功能基团：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、 组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的 羟基等，当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求 不参与酶的固定化结合 酶的高级结构：要避免用高温、强酸、强碱等处理， 而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，因 此，操作应尽量在非常温和的条件下进行。
颗粒大小可实时监控
第五章固定化酶和细胞
脂质体包裹酶
第五章固定化酶和细胞
结合法
选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的 固定化方法。
根据酶与载体结合的化学键不同，可分为：
离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子 键结合法。离子键结合法所使用的载体是某些不溶于水的离子交换 剂。常用的有DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。
由于靠物理吸附作用，结合力 较弱，酶与载体结合不牢固而容易 脱落，所以使用受到一定的限制。
第五章固定化酶和细胞
包埋法
将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶 固定化的方法。
包埋法使用的多孔载体主要有：琼脂、琼脂 糖、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺、 光交联树脂、聚酰胺、火棉胶等。
根据载体材料和方法的不同，可分为：
Chapter 5 Immobilized Enzyme and Cell
固定化酶和细胞
第五章固定化酶和细胞
酶应用过程中的主要瓶颈
酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶，如α-淀粉酶、Taq酶等；和 胃蛋白酶等可以耐受较低的pH条件以外，大多数的酶在高温、强酸、 强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活。
凝胶包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一定 形状的固定化酶或固定化含酶菌体。大多数为球状或片状，也可按需要 制成其他形状。常用的凝胶有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明 胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成凝胶。
半透膜包埋法：将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成固 定化酶。常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等
第五章固定化酶和细胞
酶和细胞固定化的模式
第五章固定化酶和细胞
吸附法
利用各种固体吸附剂将酶或含 酶菌体吸附在其表面上，而使酶固 定化的方法。
常用的固体吸附剂有活性炭、 氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔 玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。
操作简便，条件温和，不会引 起酶变性失活，载体廉价易得，而 且可反复使用。
第五章固定化酶和细胞
首先被采用包埋法的酶有：
• 固定化胰蛋白酶 • 固定化木瓜蛋白酶 • 固定化－淀粉酶 Enzyme+N,N-甲叉双丙烯酰胺，丙烯酰胺，引发 剂
第五章固定化酶和细胞
海藻酸钙包埋法装置
将水溶性的海藻酸钠配成水溶液， 并把酶或细胞分散在其中，然后将 其滴入凝固浴中（常用CaCl2 溶 液），使海藻酸钠中的Na+，部分 被Ca2+所取代而形成由多价离子交 联的离子网络凝胶。
酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系 统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力， 也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高， 而且难于连续化生产。
产物的分离纯化较困难：酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给 产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。