酶联免疫吸附实验讲义全解

间接性ELISA原理：
显色
夹心法

是先将未标记的抗体包被在酶标板上，用 于捕获抗原，在用酶标的抗体与抗原反应 形成抗体-抗原-酶标抗体复合物；也可以 象间接法一样应用酶标二抗和抗体-抗原抗体复合物结合，形成抗体-抗原-抗体酶标二抗复合物。前者称为直接夹心法， 后者称为间接夹心法。
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双抗体夹心ELISA检测传染 性支气管炎病毒（IBV ）
2010年吕梁市兽医实验室培训
酶联免疫吸附试验
Enzyme linked immunosorbent assay
ELISA
吕梁市动物疫病预防控制中心 刘裕田
1、酶联免疫吸附测定法 （ELISA）简介


1.1、基本概念：抗原、抗体、抗原抗体 的特性 1.2、ELISA方法简介： 1.3、ELISA方法的原理 1.4、ELISA方法的分类
3、ELISA实验过程

3.1 、试剂的准备 3.2 、加样 3.3 、保温 3.4、 洗涤 3.5 、显色和比色
4、ELISA试验的质量控制


4.1 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.2
分析前质控 人员培训 仪器质控 标本采集及处理过程的质控 分析中质控
2、ELISA试剂的组成

2、ELISA试剂的组成

2.1、 ELISA试剂盒的组成 2.1.1、已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸 附剂，俗称酶标板）； 2.1.2、酶标记的抗原或抗体（酶标记物）； 2.1.3、酶的底物； 2.1.4、参考标准品（定量测定）； 2.1.5、酶标记物及样本的稀释液； 2.1.6、洗涤液； 2.1.7、酶反应终止液。

1、酶联免疫吸附反应法（ELISA）




1.1、基本概念： 抗原：抗原是指进入人或动物机体后，可刺激机 体免疫系统发生免疫应答，从而引起动物产生抗 体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗体或致敏淋巴 细胞发生特异性反应的物质。 抗体：是由抗原刺激动物的免疫系统后，由免疫 系统产生分泌的能和相应抗原发生特异性结合的 免疫球蛋白。 抗原抗体的基本特性：a、反应的特异性；b、反 应的等比例性
加终止液 加底物显色 加羊抗兔IgG-HRP 加兔抗IBVIgG
IBV
加IBV或被检 包被鸡抗NP蛋白IgG
双抗原夹心法测抗体(抗HIV、Tp)
待测 抗体
E
E
酶标 抗原
E
底物
显色
洗板
洗板
温育
E E
E
E E
E
固相 抗原
液相阻断ELISA




用于检抗体，得到的结果比间接ELISA可靠。其过 程如下： 抗原包被酶标板，加待检血清，后加酶标抗体， 底物显色，终止。 如果待检样阳性则与酶标板上包被的抗原结合， 阻断酶标抗体与其反应。 结果OD越高，为阴性，低为阳性 实验中用标准阴性和阳性血清阻断率来判断实验 精确度，得到的结果有较好的线形关
1.4、ELISA方法的分类

直接法： 直接法是指酶标抗原或抗体直接与包被 在酶标板上的抗体或抗原结合形成酶标 抗原—抗体复合物，加入酶反应底物， 测定产物的吸光值，计算出包被在酶标 上的抗体或抗原的量。见图2-17（a）
间接性ELISA

是将酶标记在二抗上，当抗体（一抗） 和包被在酶标板的抗原结合形成复合后， 再以酶标二抗和复合物结合，通过测定 酶反应产物的颜色可以（间接）反应一 抗和抗原的结合情况，进而计算出抗原 或抗体的量。
1.2、ELISA方法简介
ELISA属于标记免疫学技术的一种， 1971年由荷兰和瑞典的学者提出，由于 其操作过程简单易行并可以定量，从而 使其在食品安全和微生物检测中得到了 广泛的应用。目前市场上有多种基于 ELISA方法开发的用于病原微生物以及食 品中抗生素检测的试剂盒产品。
1.3、ELISA方法的原理

基于抗原抗体反应的特异性和等比例性，以96孔的聚苯乙烯塑料微孔 板（又称酶标板）为载体，在适当的技术条件下使抗原或抗体包被（吸 附）在酶标板微孔的内壁上成为所谓的包被（固相）抗体或抗原，没有 被吸附（游离）的抗原或抗体通过洗涤除去，然后直接加入酶标记抗体 或抗原（或先加入适当的抗体或抗原与包被抗原或抗体反应后，再加入 相应的酶标记抗体或抗原），形成酶标记的抗原—抗体复合物固定在微 孔内，没有吸附的酶标记物洗涤去除，加入底物溶液于微孔中，复合物 上的酶催化底物使其水解、氧化或还原成为有色的底物。在一定的条件 下，复合物上酶的量（也反映了固定化的抗原抗体复合物的量）和酶产 物呈现的色泽成正比，因此可以用分光光度计进行测定，从而计算出参 与反应的抗原和抗体的量。这就是ELISA的原理。
2.1、 ELISA试剂盒的组成 2.1.1、已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸 附剂，俗称酶标板）； 2.1.2、酶标记的抗原或抗体（酶标记物）； 2.1.3、酶的底物； 2.1.4、参考标准品（定量测定）； 2.1.5、酶标记物及样本的稀释液； 2.1.6、洗涤液； 2.1.7、酶反应终止液。


2.2.1、固相载体： 固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器， 不参与化学反应。可作ELISA中载体的材料很多， 最常用的是聚苯乙烯。ELISA载体的形状主要有 三种：微量滴定板、小珠和小试管。以微量滴定 板最为常用，专用于EILSA的产品称为ELISA板， 国际上标准的微量滴定板为8×12的96孔式。 2.2、免疫吸附剂： 已包被抗原或抗体的固相载体，是ELISA方法中 的核心试剂。

3、ELISA实验过程
3.1 、试剂的准备 3.2 、加样 3.3 、保温 3.4、 洗涤 3.5 、显色和比色

4、ELISA试验的质量控制
5、胶体金试纸 5.1、免疫层析法简介及特点 5.2、免疫层析法的结构及原理

二、培训内容（操作部分） 6、操作过程演示 7、计算软件应用说明
2、ELISA试剂的组成

2.1、完整的ELISA试剂盒应包含以下： （1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫 吸附剂，俗称酶标板）； （2）酶标记的抗原或抗体（酶标记物）； （3）酶的底物； （4）系列参考标准品（定量测定）； （5）酶标记物及样本的稀释液； （6）洗涤液； （7）反应终止液。