第六章 药物安全性检查技术

举例-注射用硫酸链霉素中细菌内毒 素的检查 • 一、试剂和样品
• 鲎试剂（批号：040317 灵敏度λ ：0.25EU/ml；规格均为 0.1ml/支；湛江海洋生物制品厂生产） • 细菌内毒素检查用水（批号：031229 规格： 2ml/支； 湛江海洋生物制品厂生产） • 细菌内毒素工作标准品（内毒素工作标准品 2004-2 ， 160EU/支，中国药品生物制品检定所提供） • 注射用硫酸链霉素（规格：1.0 g/1.0ml 批号：20020523
MVD=10EU/mg×1.6mg/ml ÷0.25EU/ml=64（倍）
一 细菌内毒素的鲎试剂检查法
• 方法步骤
1.鲎试剂灵敏度复核试验 目的：检查当所使用的 鲎试剂灵敏度是否与标 示灵敏度有差异，是否 影响检验结果 目的：检查鲎试剂、供 试品配方、检查用的水 等试验条件是否影响实 验结果 目的：检查供试品内毒 素是否合格
热原实验室内外应保持安静，避免日光直射。
一
注意事项
热原的家兔检查法
捉拿家兔时，应一只手抓住颈部，一只手托其臀部 ，避免其挣扎。整个过程中要避免家兔骚动以保持 体温恒定。 注射时，先用75%酒精棉擦耳朵边缘，再由兔耳静 脉缓缓注入规定剂量的供试液。注射完毕用手捏住 针眼处，以助止血。
试验过程中，要及时填写兔卡和原始记录。
c lg 1 ( X / 4)
式中：X为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是指系 列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。
举例-注射用硫酸链霉素中细菌内毒 素的检查
2.0λ 内毒素溶液 1.0λ 内毒素溶液
++++ +++－ ++－－ －－－－ －－－－
阳 性
0.5λ 内毒素溶液
2.0λ 内毒素溶液 内毒素溶液 37±1℃ 保温1h
呈阳性
0.1ml 1.0λ 0.1ml 0.1ml 0.1ml
0.5λ 内毒素溶液
结 果 有 效
4支
2支
0.25λ 内毒素溶液
呈阴性 内毒素检查用水 计算鲎试 剂灵敏度
当λc在0.5λ～2.0λ时，方可 用于内毒素检查，并以λC 为 该批鲎试剂灵敏度
细菌内毒素检查作为控制药品质量的一种方法， 已经广泛的被世界各国药典收载。 • 成品检查——药品安全性检查之一 • 半成品（生产过程）检查——事前质控手段，避免 造成药品成批报废
一 细菌内毒素的鲎试剂检查法
• 鲎的图片
鲎的长相既像虾又像蟹，人称之为“马蹄蟹”,是一类与三叶虫(现在 只有化石)一样古老的动物。
工作标准品：
经国家标准品稀释用于试验中鲎试剂灵敏度符 复核、干扰试验及各种阳性对照；
一 细菌内毒素的鲎试剂检查法
• 名词解释—鲎试剂
鲎（hòu）是一种海洋节肢动物，其血液 中含有一种有核变形细胞，这种细胞的胞浆 中含有凝固酶原和凝固蛋白原。将此物质进 行提取，经低温冷冻干燥而成的生物试剂即 为鲎试剂，专用于细菌内毒素检测。
一 细菌内毒素的鲎试剂检查法
• 基本概念1—细菌内毒素限值（L）
指人对药品中细菌内毒素所能耐受的不致引起热
原反应的某定量限值（L）；
计算公式：
L=K/M
K：每公斤体重每小时最大可接受内毒素剂量，注射剂K=5EU/
/(kg.h) M:每公斤体重每小时的最大供试品剂量； 以胸腺素α1计算限值为例： L=5EU/ (kg.h) ÷(1.6mg÷60kg)=185.19 EU/mg
一 细菌内毒素的鲎试剂检查法
凝胶法
• 基本原理
内毒素（LPS）
凝固酶原
激活
凝固酶
凝固蛋白原 凝固蛋白 （溶解状态） （凝胶状态）
一 细菌内毒素的鲎试剂检查法
凝胶法
• 名词解释—国家标准品及工作标准品
国家标准品： （单位：EU/ml）
自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核 、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品 的效价；
对用过的家兔，如供试品判为符合规定，至少休 息48小时。如升温达0.6℃则应休息两周以上；
使用次数不超过十次。
一
热原的家兔检查法
对家兔的要求 健康合格，体重1.7~3.0kg，雌兔应无孕，预测体 温前七日应用同一饲料喂养病无异常；
对未使用过的家兔，或供试品判定为符合规定但 组内升温达0.6℃的家兔；或三周内未用过的家兔 ，均应在实验前3~7日内预检体温，进行挑选；
当日使用的家兔，正常体温应在 38.0~39.6 ℃，且同组各 兔间正常体温之差不得超过1℃。 试验用的注射器、针头及一切和供试品接触的器皿，应 置烘箱中250℃加热30min，或180℃加热2h，也可用其他 适宜方法除去热原。
一
检查法
热原的家兔检查法
测家兔正常体温后15min内，由耳静脉缓缓注入规 定剂量并温热至38℃的供试品溶液，然后每隔 30min测体温1次，连续测6次。 每只家兔正常体温与注射供试品溶液后6次测量体 温中最高的体温之差，即为该兔的升高温度。 如3只家兔中有1只体温升高0.6℃或以上，或3只家 兔体温升高均低于0.6℃但升高总和达1.4℃或以上 ，则另取5只家兔复试，方法同上。
检查结果的准确性和一致性取决于试验动物的 状况、试验室条件和操作的规范性。
一
热原的家兔检查法
对家兔的要求 健康合格，体重1.7~3.0kg，雌兔应无孕，预测体 温前七日应用同一饲料喂养病无异常；
对未使用过的家兔，或供试品判定为符合规定但 组内升温达0.6℃的家兔；或三周内未用过的家兔 ，均应在实验前3~7日内预检体温，进行挑选；
0.25λ 内毒素溶液 内毒素检查用水
λc = 0.354EU/ml
二 细菌内毒素的鲎试剂检查法
• 方法步骤
1.鲎试剂灵敏度复核试验 目的：检查当所使用的 鲎试剂灵敏度是否与标 示灵敏度有差异，是否 影响检验结果 目的：检查供试品配方、 检查用的水等试验条件 是否影响实验结果 目的：检查供试品内毒 素是否合格
近年来已经普遍采用细菌内毒素检查法，逐渐替代了热原法
一 细菌内毒素的鲎试剂检查法
• 与热源对比内毒素检查法优势
• 方便、快捷、经济； • 重现性好、灵敏度高； • 避免抗原的产生，克服生物测定的误差；
近年来已经普遍采用细菌内毒素检查法，逐渐替代了热原法
一 细菌内毒素的鲎试剂检查法
• 在药检中的应用
一 细菌内毒素的鲎试剂检查法
• 热源=内毒素 ？
热原指微生物产生的某些多糖蛋白复合物等使 人体发热的物质，不仅仅是细菌内毒素。 但在药检的范畴，细菌内毒素是主要的热原物 质，可以说无内毒素就无热原，控制内毒素就是控 制热原。
一 细菌内毒素的鲎试剂检查法
• 与热源对比内毒素检查法优势
• 方便、快捷、经济； • 重现性好、灵敏度高； • 避免抗原的产生，克服生物测定的误差；
2.干扰实验
3.凝胶适量试验
一 细菌内毒素的鲎试剂检查法
1.鲎试剂灵敏度复核试验
（1）根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒 素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素 检查用水溶解，然后制成2 λ 、 λ 、0.5 λ和0.25 λ共4个 浓度的内毒素标准溶液。
标示值（λ）：购买的鲎试剂所标示的标示灵敏度。也就是 该鲎试剂按照规定方法能检测到样品中内毒素的浓度，单位： EU/ml
3只家兔1只体温升高0.6℃或以上
3只家兔升温均低于0.6℃但升温总和达1.3℃或以 上
一
结果判定
热原的家兔检查法
3. 有下列情况者，判为不符合规定： 在初试3只家兔中，体温升高0.6℃或以上的超过一 只 复试的5只家兔中，体温升高0.6℃或以上的家兔超 过一只 在初试与复试合并的8只家兔中体温升高总和超过 3.5℃
热原→吞噬细胞吞噬→白细胞崩解，释放内源性 致热原→作用于体温调节中枢→产热增加、散热 减少→体温上升
• 家兔法 热原检查
细菌内毒 素检查 • 鲎（hou） 试剂法
除另有规定外，《中国药典》二部规定了静脉用 注射剂均需进行热原或细菌内毒素的检查
一
热原的家兔检查法
由于家兔对热原的反应与人基本相似，家兔法 为各国药典规定的检查热原的法定方法。 此法是将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体 内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况 ，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规 定。
生产厂家：大连美罗大药厂）
内毒素工作标准品或国家标准品
稀 释
内毒素检查用水溶解15min
支 规 格 鲎 0.1ml 复溶 试 剂 内毒素检查 原 安 用水 瓿 支 18
0.1ml/
4支 4支
4支
0.1ml
2.0λ 内毒素溶液 内毒素溶液 37±1℃ 保温1h
呈阳性
0.1ml 1.0λ 0.1ml 0.1ml 0.1ml
• 家兔法 热原检查
细菌内毒 素检查 • 鲎（hou） 试剂法
除另有规定外，《中国药典》二部规定了静脉用 注射剂均需进行热原或细菌内毒素的检查
一 细菌内毒素的鲎试剂检查法
• 主要来源源自文库
主要来自于革兰氏阴性杆菌，当细菌死亡或自溶 后便会释放出内毒素，其化学成分主要是脂多糖， 这是一种大分子物质，分子量约为106，其粒径约 在1~ 5纳米 。 细菌内毒素广泛存在于自然界中。如自来水中含 内毒素的量为1至100EU/ml。
酸碱滴定分析法
第六章 药物安全性检查技术
公共卫生与护理学院
魏友利
目录
01 热原检查技术
02 无菌和微生物限度检查技术
定 义 热原是指能引起恒温动物和人体 体温异常升高的致热物质。广义上包 括细菌性热原、内源性高分子热原、 内源性低分子热原及化学热原等。药 剂中的“热原”通常是指细菌性热原， 是微生物产生的代谢产物。
家兔在实验前至少一小时开始停止给食，并置于 宽松装置中，直至实验完毕。 测温装置精密度应为±0.1℃。
一
准备工作
热原的家兔检查法
测温探头或肛温计插入肛门的深度和时间各兔应相同， 深度一般约6cm，时间不得少于一分半钟，每隔30分钟测 量一次，一般测两次，两次体温之差不超过 0.2 ℃，以平 均值作为该兔正常体温。
药典规定标准：小于10EU/ml
一 细菌内毒素的鲎试剂检查法
• 基本概念2—确定最大有效稀释倍数（MVD）
指供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀
释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测；
计算公式：
MVD=cL/ λ
λ ：鲎试剂灵敏度
L：供试品的细菌内毒素限值 c：供试品溶液的浓度
以胸腺素α1计算最大稀释倍数为例：
一
结果判定
热原的家兔检查法
1. 判为符合规定： 在初试3只家兔中，体温升高均低于0.6℃并且升 高总和低于1.3℃ 在复试5只家兔中，体温升高0.6℃或以上的家兔 不超过一只，并且初试与复试合并8只家兔的体 温升高总和为3.5℃或以下
一
结果判定
热原的家兔检查法
2. 有下列情况者，复试一次：
对用过的家兔，如供试品判为符合规定，至少休 息48小时。如升温达0.6℃则应休息两周以上；
使用次数不超过十次。
一
准备工作
热原的家兔检查法
每批供试品初试用3只，复试5只。在检查前1~2 日，家兔应处于同一温度环境中，实验室应为 17~25℃，与饲养室温度相差不大于3℃，并防止 动物躁动和避免噪声干扰。
鲎的血液中含有铜离子，它的血液是蓝色的。这种蓝色血液的 提取物——“鲎试剂”，可以准确、快速地检测人体内部组织 是否因细菌感染而致病；在制药和食品工业中，可用它对毒素 污染进行监测。
一 细菌内毒素的鲎试剂检查法
• 《中国药典》批准使用方法：
测定 方法
凝胶法 浊度法 光度测定法 显色基质法
• 供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验 。但当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶 法结果为准。 • 本节将着重介绍凝胶法法的操作与有关原理。
0.5λ 内毒素溶液
4支
2支
0.25λ 内毒素溶液
呈阴性 内毒素检查用水
细菌内毒素检查法——凝胶法
试验结果（阴、阳性）判定：
内毒素工作标准品或国家标准品
稀 释
内毒素检查用水溶解15min
支 规 格 鲎 0.1ml 复溶 试 剂 内毒素检查 原 安 用水 瓿 支 18
0.1ml/
4支 4支
4支
0.1ml
一
结果判定
热原的家兔检查法
4. 出现负值的规定如下：
当家兔升温为负值时，均以0℃计。
一
注意事项
热原的家兔检查法
尽量使用热原测温仪测温，因为其感温探头在整个 测温过程中都置于家兔肛门内，所测体温较正确， 同时也避免了漏检现象。 热原耐热性好，但在180℃3~4h，或200℃ 60min， 或250℃ 30~45min可彻底破坏热原。因此耐热物品 如玻璃制品、注射器等均可用此法破坏热原。