培养条件对纳豆芽孢杆菌芽孢形成的影响

菌种的稳定性试验（ 表 ３） 表明， ｓｇ２－ Ｎ２－ ２ 菌株接 于褶皱型菌落。
种传 ３ 代， 生物效价无明显影响。
３ 讨论
表 ３ ｓｇ２－ Ｎ２－ ２ 斜面传代对发酵效价的影响
传代代数
Ｆ１
Ｆ２
Ｆ３
Ｆ４
Ｆ５
相对效价（ ％）
１００
９９
１０２
９０
７８
诱变育种方法简便有效， 至今仍是工业微生物育 种的重要手段， 但一般都需要对很大数量的菌株进行 筛选方能奏效， 这种育种方式近年来在理论与技术上
都有新的发展， 但如何提高效率， 减少盲目性， 仍是当 前的重要问题。在黄霉素高产菌株的筛选过程中， 本文 采用了抗自身代谢推理选育方法。
本实验中采用亚硝酸钠诱变， 从结果看， ＤＭＳ４０７４６ 对亚硝酸钠很敏感， 在诱变 ３０ｍｉｎ 得到的 菌株正突变高， 经过亚硝酸钠诱变和耐自身代谢处理 得到了 ｓｇ２－ Ｎ２－ ２ 菌株， 其产黄霉素的能力是原 菌株 的 ７．２ 倍。
加 Ｃ 源、Ｎ 源或无机盐配制培养基。Ｃ 源基础培养基： 进行纳豆芽孢杆菌的摇瓶培养， 结果如表 １ 所示。
酵母膏 ３ｇ／ｌ、蛋白胨 １０ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ， ｐＨ 值 ７．２～７．４； Ｎ
实验结果表明： 纳豆芽孢杆菌 ＪＳ－ ＮＤＴ－ ０５ 具有
源基础培养基： 葡萄糖 ５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ， ｐＨ 值 ７．２～７．４。 良好的淀粉酶活性， 能直接利用淀粉且生长良好。与
《 饲料工业》·２００６ 年第 ２７ 卷第 ８ 期
生物技术
培养条件对纳豆芽孢杆菌芽孢形成的影响
孙 梅 匡 群 施大林 刘 淮 胡凌红 陈秋红 沈 玥 陆茂林 司竑飞
源自文库
摘 要 为了提高纳豆芽孢杆菌芽孢形成率及芽孢数量， 在摇瓶、１５Ｌ 自动发酵罐中考察了营养 条件、ｐＨ 值、接种量、溶氧水平对纳豆芽孢杆菌液体培养形成芽孢的影响。结果表明， 芽孢形成的最适 培养基组成为： 葡萄糖 １５ｇ／ｌ、大豆饼粉 １０ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ３ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ ０．４ｇ／ｌ， ｐＨ 值 ７．０， 接种 后最适起始芽孢浓度为 １０６ 个／ｍｌ，控制溶氧水平不低于 ３０％， 培养 ２０ｈ，芽孢数量可达 ７．７×１０９ 个／ｍｌ，芽 孢率达 ９８％以上。
１．３．３ 活菌及芽孢检测用培养基 营养琼脂（ ＮＡ） 培养基［９］。
１．４ 器材
葡萄糖、乳糖等速效碳源相比较， 在玉米淀粉、小麦淀 粉等淀粉类长效碳源中， 菌体生长较慢， １４～１６ｈ 时生 长 进 入 平 衡 期 ， 比 葡 萄 糖 、乳 糖 等 速 效 碳 源 晚 ２～６ｈ。
ｐＨ 计（梅特勒－ 托利多 Ｄｅｌｔａ３２０ｐＨ）、ＨＹＧ－ １１ａ 迥 在芽孢形成方面， 淀粉类碳源的芽孢形成极缓慢， 培
相同， 是枯草芽孢杆菌的一个亚种［１］。纳豆芽孢杆菌能 验研究表明， 添加纳豆芽孢杆菌能使肠道酸化而有利
产生具有溶纤活性的纳豆激酶［２］，其芽孢能耐酸碱、耐 于铁、钙及维生素 Ｄ 等的吸收， 促进动物生长， 缩短饲
高温（１００℃）及耐挤压， 在饲料制粒过程及酸性胃环境 养 周期， 同 时纳 豆芽 孢 杆菌 具 有 很 强 的 蛋 白 酶 、脂 肪
收稿日期： ２００６－ ０２－ １０
的应用日益扩大。
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和复筛发酵， 获得数株高产菌株， 其中 ｓｇ２－ Ｎ２－ ２ 菌 株
从表 ４ 中可看出， 不同型菌落的生产能力差异较
摇瓶发酵效价比亲株提高 ７．２ 倍。
大， 褶皱型菌株产量高。筛选出的 ｓｇ２－ Ｎ２－ ２ 高产菌属
ｐＨ 值
７．７１ ８．５０ ８．３５ ８．４０ ８．６４ ８．１５ ８．０１ ８．０１
备注
１６ｈ 菌体生长进入平衡期， ４０ｈ 菌体开始形成芽孢 １４ｈ 菌体生长进入平衡期， ４０ｈ 时菌体形成芽孢 １４ｈ 菌体生长进入平衡期， ２４ｈ 开始形成芽孢 １６ｈ 菌体生长进入平衡期， ２２ｈ 开始形成芽孢 １０ｈ 菌体生长进入平衡期， 开始形成芽孢 １０ｈ 菌体生长进入平衡期， 开始形成芽孢 １２ｈ 菌体生长进入平衡期， 开始形成芽孢 １０ｈ 菌体生长进入平衡期， 开始形成芽孢
由于纳豆芽孢杆菌的芽孢较其营养体细胞易保 成熟。
藏 ， 复活 率 高， 是 制 备纳 豆芽 孢 杆 菌 制 剂 的 理 想 存 在 ２．１．２ 摇瓶培养
形式。因此， 获得高浓度、高活性的芽孢是制备纳豆芽
将成熟的种子用无菌水从斜面上刮洗下来， 放入
孢杆菌制剂的关键。目前， 国内对纳豆芽孢杆菌的研 内装无菌玻璃珠的灭菌三角瓶中， 振荡， 制成均匀的
２．４ 菌落形态与生产能力的关系 在筛选过程中， 发现菌落形态与亲本菌株形态发
生变化， 并且与生产能力存在一定的相关性， 从分离 出来的菌落形态可归纳出下列 ３ 种。
Ⅰ型扁平型， 表面平滑， 白色菌落，孢子丰满； Ⅱ 型褶皱型， 边缘不整齐， 孢子丰满； Ⅲ型光秃型， 表面 平滑， 白色小菌落， 孢子稀少。
杆菌液体培养形成芽孢的营养条件、ｐＨ 值、接种量、 ２．１．３ １５Ｌ 自动发酵罐培养
溶氧水平方面进行研究， 为纳豆芽孢杆菌芽孢制剂的 产业化生产提供参考。
发酵罐装液量 ７０％～８０％（ｖ／ｖ）， 将成熟的斜面种子 菌悬液经 ８０℃水浴加热 １０ｍｉｎ 后， 接入 １５Ｌ 自动发酵
１ 材料
罐， ３７℃培养 ２４ｈ 左右， 搅拌转 速 ３００～４５０ｒ／ｍｉｎ， 通气
究大 多 集中 于 纳豆 固体 培 养、纳 豆 激 酶 ， 液 体 深 层 培 养研究也以收获营养活菌体为目的， 在其芽孢形成方
菌 悬 液 ， ８０℃水 浴 加 热 １０ｍｉｎ， 以 ２％（ｖ／ｖ）的 接 种 量 接 入孢子悬液， 摇瓶装量 １０％～２０％（ｖ／ｖ）， 在 ３７℃条件下，
面的研究不多。因此， 本文旨在通过对影响纳豆芽孢 ２００～２２０ｒ／ｍｉｎ 的迥摇培养 ２０～４８ｈ。
表 ４ 不同型菌落的生产能力
诱变后的菌落形态发生了变化， 并且与生产能力
菌落形态
Ⅰ型
Ⅱ型
Ⅲ型
相对效价（ ％）
７８
１００
８９
有关， 褶皱型菌株产量高， 为该菌株以后的诱变筛选 工作提供了条件。 （ 编辑： 孙崎峰， ｓｑｆ０４５２＠１２６．ｃｏｍ）
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生物技术
孙梅等： 培养条件对纳豆芽孢杆菌芽孢形成的影响
在 Ｃ 源基础培养基中， 以葡萄糖为 Ｃ 源， 配制含 不同葡萄糖浓度的培养基， ２５０ｍｌ 三角瓶分装培养基 ２５ｍｌ， 进 行 摇 瓶 培 养 ， 考 察 葡 萄 糖 浓 度 对 纳 豆 芽 孢 杆 菌 ＪＳ－ ＮＤＴ－ ０５ 芽孢形成的影响， 结果如图 １ 所示。
数是在 ８０℃水浴加热 １５ ｍｉｎ 后， 采用平板菌落计数法 检测芽孢的生成量［１１］； 芽孢染色法观察芽 孢［１０］； 芽 孢 率 是 指 样 品 按 活 菌 总 数 计 数 、芽 孢 平 板 计 数 分 别 计 数 活 菌总数和芽孢数， 计算公式为：
生饼粉均为市售。 １．３ 培养基
芽孢率（ ％） ＝（ 芽孢数／活菌总数） ×１００％。 ３ 结果与讨论
活菌数
（ 个／ｍｌ） １．１×１０９ ５．４×１０８ ７．３×１０８ ４．１×１０８ ２．８×１０８ ５．８×１０８ ４．１×１０８ ６．１×１０８
芽孢数
（ 个／ｍｌ） ０
１．１×１０８ ６．８×１０８ ３．７×１０８ ２．７×１０８ ５．２×１０８ ２．５×１０８ ５．７×１０８
芽孢率 （ ％） ０ ２０．０ ９３．５ ９０．０ ９５．０ ９０．０ ６０．０ ９３．６
孙梅， 江苏省微生物研究所有限公司， 助理研究员， ２１４０６３， 无锡市钱荣路 ７ 号。
匡群（ 通讯作者） 、施大林、刘淮 、胡 凌 红 、陈 秋 红 、沈 ， 单 位及通讯地址同第一作者。
陆茂林、司 飞， 江苏省微生物制药工程中心。
日粮中添加纳豆芽孢杆菌能明显提高仔猪生长性能 和饲料转化率， 经济效益显著； 日粮中添加适宜用量 的纳豆芽孢杆菌能提高鸡十二指肠消化酶的活力， 显 著提高肉仔鸡生长性能。因此， 纳豆芽孢杆菌是一种 较好的微生物饲料添加剂， 目前在家畜及水产养殖中
１．３．１ 斜面种子培养基 ＢＰＹ 培 养 基 ［８］： 牛 肉 膏 ５ｇ／ｌ、酵 母 膏 ５ｇ／ｌ、蛋 白 胨
１０ｇ／ｌ、葡 萄 糖 ５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／ｌ、琼 脂 １５ ～２０ｇ／ｌ、蒸 馏 水 １Ｌ， ｐＨ 值 ７．２。
３．１ Ｃ 源对芽孢形成的影响 在培养基成分中， 碳源及其浓度是影响芽孢形成
关键词 纳豆芽孢杆菌； 芽孢形成； 培养条件 中图分类号 Ｑ８１５
纳豆 芽 孢 杆 菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎａｔｔｏ）是 从 日 本 传 统 食 品 以厌氧菌为优势菌群的肠道正常菌群的生长， 促进动
中分离出来的芽孢杆菌， 其原始菌株与枯草芽孢杆菌 物对营养物质的吸收， 增强机体的免疫功能［４］。体外试
２．１ 培养方法 ２．１．１ 种子培养
用接种针从菌种斜面上沾取少量菌泥， 划线接种
的菌体形成了芽孢， 而玉米淀粉和小麦淀粉则不理 想； 而在葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖培养基中， 菌体在 １０ｈ 左 右 生 长 进 入 平 衡 期 后 即 开 始 形 成 芽 孢 ， 培 养
于 ＢＰＹ 培养基， ３７℃培养 １８～２４ｈ， 镜检以芽孢为主即 ２４ｈ， 除麦芽糖芽孢形成不理想外， 葡萄糖、乳糖、蔗糖
中均 能 保持 高 度的 稳定 性； 在肠 道 中 不 增 殖 ， 只 在 肠 酶 、淀 粉酶 活性 ， 能 降解 植 物性 饲 料 中 某 些 复 杂 的 碳
道上段迅速发育转变成代谢活跃的营养型细胞［３］， 增强 水化合物， 从而提高饲料的转化率并增加饲料的可利
用种类［５］。动物饲养试验结果表明［６， ７］， 在仔猪前、后 期
的主要因素［１２－１５］，在 Ｃ 源基础培养基中分别添加不同 Ｃ 源， 即： 玉米淀粉 ２０ｇ／ｌ、小麦淀粉 ２０ｇ／ｌ、木薯淀粉 ２０ｇ／ｌ、
１．３．２ 摇瓶培养基
红薯淀粉 ２０ｇ／ｌ、乳糖 ５ｇ／ｌ、蔗糖 ５ｇ／ｌ、麦 芽糖 ５ｇ／ｌ、葡 萄
根据试验 需 要配 制 培养 基或 在 基础 培 养基 中 添 糖 ５ｇ／ｌ， 配制培养基， ２５０ｍｌ 三角瓶分装培养基 ５０ｍｌ，
旋式恒温调速摇瓶柜 （上 海 欣蕊 自动 化 设备 有 限公 司 ）、自 动 发 酵 罐 （Ｂ．ＢＲＡＵＮ ＢＩＯＳＴＡＴ Ｃ１５－ ３）、７２１ 分 光 光 度 计 （上 海 精 密 科 学 仪 器 有 限 公 司）。 ２ 方法
养 ２４ｈ 左右 镜检 ， 除 木 薯 淀 粉 、红 薯 淀 粉 培 养 基 中 有 少数菌体开始形成芽孢外， 玉米淀粉和小麦淀粉培养 基中的菌体均呈营养体形态， 未形成芽孢， 延长培养 时间至 ４０ｈ， 木薯淀粉、红薯淀粉分别有 ９３．５％、９０％
ｐＨ 值测定用梅特勒－ 托利多 Ｄｅｌｔａ３２０ｐＨ 计测定； 活菌总数计数采用周佳庆介绍的方 法［１０］； 芽孢 平 板计
米浆粉、酵母粉均为国产生化试剂； 尿素、葡萄糖、 ＮＨ４Ｃｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ、ＭｇＳＯ４· ７Ｈ２Ｏ、ＣａＣＯ３ 为国产分析纯试剂； 玉米淀粉、小麦淀 粉 、木薯 淀 粉、红 薯淀 粉 、鱼粉 、大 豆粉 、大 豆 饼 粉 、花
１．１ 菌种
量 ４．０Ｌ／ｍｉｎ。培养过程中 ｐＨ 值、溶氧水平可根据实验
纳 豆 芽 孢 杆 菌 （ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎａｔｔｏ） ＪＳ－ ＮＤＴ－ ０５， 由 江 需要进行电脑自动控制和监测。
苏 省 微 生 物 研 究 所 选 育 、分 离 纯 化 和 保 藏 。
２．２ 测定方法
１．２ 试剂 乳糖 、蔗糖 、麦 芽糖 、蛋 白 胨 、酵 母 膏 、牛 肉 膏 、玉
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孙梅等： 培养条件对纳豆芽孢杆菌芽孢形成的影响
生物技术
表 １ 不同 Ｃ 源对芽孢形成的影响
Ｃ 源添加量 （ ｇ／ｌ）
玉米淀粉 小麦淀粉 木薯淀粉 红薯淀粉 乳糖 蔗糖 麦芽糖 葡萄糖
浓度 （ ｇ／ｌ） ２０ ２０ ２０ ２０
５ ５ ５ ５
培养时间 （ ｈ） ４０ ４０ ４０ ４０ ２４ ２４ ２４ ２４
均已有 ９０％以上的菌体形成了芽孢。从总体看来， 玉 米淀粉的营养菌体数量最多， 但不利于芽孢形成； 木 薯淀粉芽孢形成数量最高， 葡萄糖次之， 两者的芽孢 形成率相近， 但所需培养时间 不同， 木 薯淀 粉需 ４０ｈ， 而葡萄糖只要 ２４ｈ。因此， 葡 萄糖 对 纳豆 芽 孢杆 菌的 芽孢形成最适宜。