ELISA
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酶联免疫吸附实验 (ELISA)
中山医学院免疫学教研室
目的和要求
掌握ELISA的原理、操作过程及注意事项 了解ELISA实验结果的读取和分析
实验原理
借助酶标记抗体（或抗原）在体外与抗 原（或抗体）结合，通过相应底物被酶 解后出现显色反应。反应颜色深浅与抗 原（或抗体）量的多少有关。 特点：灵敏、特异 类型： 双抗体夹心法、竞争法、间接法等
终止反应:每孔加1 10％ 终止反应:每孔加1滴10％硫酸
结果观察
注意事项
加样：应将所加物加在ELISA板孔的底部， ELISA板孔的底部 加样：应将所加物加在ELISA板孔的底部，并 注意不可溅出，不可产生气泡。 注意不可溅出，不可产生气泡。 洗板：每次洗液加入后，应静置1 洗板：每次洗液加入后，应静置1分钟使清洗 更加彻底。末次洗板尽量将水甩干。 更加彻底。末次洗板尽量将水甩干。 液体全部加完后， 液体全部加完后，可将酶标板在桌子上平行轻 轻晃动30 30秒 混匀液体 液体。 轻晃动30秒，混匀液体。 底物有毒性，终止液对皮肤有腐蚀性， 底物有毒性，终止液对皮肤有腐蚀性，尽量避 毒性 免接触。 免接触。
洗板3 洗板3次,每次1min 每次1min
加入100ul酶标抗体, 37℃孵育 孵育30min 加入100ul酶标抗体, 37℃孵育30min 100ul酶标抗体
洗板3 洗板3次,每次1min 每次1min
实验步骤
加入100ulTMB底物液避光室 加入100ulTMB底物液避光室 100ulTMB 温孵育15min 温孵育15min
双抗夹心法ELISA
竞争法 ELISA
实验材料
BSA包被的测定板 酶标抗鼠IgG抗体 待检血清，阳性血清，阴性血清 洗涤液： PBS＋吐温-20 底物液：邻苯二胺（OPD） 终止液：10% H2S04
实验步骤
加入稀释好的待测血清每孔100ul， 加入稀释好的待测血清每孔100 ， 稀释好的待测血清每孔100 37℃孵育 孵育40min 37℃孵育40min
血清稀释及加样
将待测血清1:100稀释后，再做倍比稀释到各孔， 将待测血清1:100稀释后，再做倍比稀释到各孔， 1:100稀释后 每孔100μl 见表。注意混匀 100μl， 混匀。 每孔100μl，见表。注意混匀。
1: 1: 1: 100 200 400 1: 1: 1: 100 200 400
1: 800 1: 800
Fra Baidu bibliotek
1: 1600 1: 1600
1: 3200 1: 3200
1: 6400 1: 6400
1: 12800 1: 12800
阴性 血清 阳性 血清
阴性 血清 阳性 血清
100ul
中山医学院免疫学教研室
目的和要求
掌握ELISA的原理、操作过程及注意事项 了解ELISA实验结果的读取和分析
实验原理
借助酶标记抗体（或抗原）在体外与抗 原（或抗体）结合，通过相应底物被酶 解后出现显色反应。反应颜色深浅与抗 原（或抗体）量的多少有关。 特点：灵敏、特异 类型： 双抗体夹心法、竞争法、间接法等
终止反应:每孔加1 10％ 终止反应:每孔加1滴10％硫酸
结果观察
注意事项
加样：应将所加物加在ELISA板孔的底部， ELISA板孔的底部 加样：应将所加物加在ELISA板孔的底部，并 注意不可溅出，不可产生气泡。 注意不可溅出，不可产生气泡。 洗板：每次洗液加入后，应静置1 洗板：每次洗液加入后，应静置1分钟使清洗 更加彻底。末次洗板尽量将水甩干。 更加彻底。末次洗板尽量将水甩干。 液体全部加完后， 液体全部加完后，可将酶标板在桌子上平行轻 轻晃动30 30秒 混匀液体 液体。 轻晃动30秒，混匀液体。 底物有毒性，终止液对皮肤有腐蚀性， 底物有毒性，终止液对皮肤有腐蚀性，尽量避 毒性 免接触。 免接触。
洗板3 洗板3次,每次1min 每次1min
加入100ul酶标抗体, 37℃孵育 孵育30min 加入100ul酶标抗体, 37℃孵育30min 100ul酶标抗体
洗板3 洗板3次,每次1min 每次1min
实验步骤
加入100ulTMB底物液避光室 加入100ulTMB底物液避光室 100ulTMB 温孵育15min 温孵育15min
双抗夹心法ELISA
竞争法 ELISA
实验材料
BSA包被的测定板 酶标抗鼠IgG抗体 待检血清，阳性血清，阴性血清 洗涤液： PBS＋吐温-20 底物液：邻苯二胺（OPD） 终止液：10% H2S04
实验步骤
加入稀释好的待测血清每孔100ul， 加入稀释好的待测血清每孔100 ， 稀释好的待测血清每孔100 37℃孵育 孵育40min 37℃孵育40min
血清稀释及加样
将待测血清1:100稀释后，再做倍比稀释到各孔， 将待测血清1:100稀释后，再做倍比稀释到各孔， 1:100稀释后 每孔100μl 见表。注意混匀 100μl， 混匀。 每孔100μl，见表。注意混匀。
1: 1: 1: 100 200 400 1: 1: 1: 100 200 400
1: 800 1: 800
Fra Baidu bibliotek
1: 1600 1: 1600
1: 3200 1: 3200
1: 6400 1: 6400
1: 12800 1: 12800
阴性 血清 阳性 血清
阴性 血清 阳性 血清
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